宋也好，李文娟，尹術(shù)華，李 露，吳文英，姚于飛

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

魚腥草(HouttuyniacordataThunb)又名蕺菜、折耳根，臭豬菜等，為三白草科植物蕺菜的干燥地上部分，最早記載于《名醫(yī)別錄》，是我國(guó)傳統(tǒng)美食，也是國(guó)家衛(wèi)生部認(rèn)證的“藥食兩用”的品種之一[1]。魚腥草具有廣泛的生物活性，而多糖為其發(fā)揮重要生物活性的成分之一。近年來(lái)，隨著對(duì)魚腥草相關(guān)研究的不斷深入，國(guó)內(nèi)外研究者們發(fā)現(xiàn)魚腥草多糖(Houttuyniacordatapolysaccharide，HCP)具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏、消炎抑菌及免疫調(diào)節(jié)等[2-5]生物活性功能。

HCP的理化性質(zhì)是研究其活性功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。2011年Tian等采[6]用高效液相色譜技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)HCP由8種單糖組成，且半乳糖和半乳糖醛酸為其主要成分。2013年Cheng B等[7]采用DEAE Sepharose CL-6B和Sephacryl S-400 HR柱分離出分子量為60 kDa且單糖組成只有半乳糖醛酸的純多糖HCP-2，并確定其是半乳糖醛酸殘基構(gòu)成的果膠類多糖。2018年Kun等[8]從魚腥草中得到相對(duì)分子量為21.7 kDa的水溶性果膠多糖HCA4S1，其單糖組成為半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸。2019年Cheng D等[9]從魚腥草水提物中純化出分子量為43 kDa果膠類酸性多糖，其主要單糖也是半乳糖醛酸和半乳糖，且單糖種類與Tian等的研究結(jié)果相同。綜上所述，不同分析方法得到的HCP的單糖組成、分子量及理化性質(zhì)不盡相同，亟需應(yīng)用先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)手段去驗(yàn)證并繼續(xù)研究HCP的基礎(chǔ)理化特性和活性功能。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法、Sevag除蛋白技術(shù)從魚腥草中獲得HCP，綜合運(yùn)用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)研究HCP的基礎(chǔ)理化性質(zhì)(包括中性糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量)、分子量、單糖組成、光譜學(xué)特性以及固態(tài)形貌特征，同時(shí)用DPPH自由基和·OH清除法來(lái)評(píng)價(jià)HCP的體外抗氧化活性，旨在為后續(xù)HCP精細(xì)結(jié)構(gòu)解析及生物活性功能探究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥草來(lái)源于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，江西江中中藥飲片有限公司生產(chǎn)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國(guó)藥典》2015年版一部。

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，分析純)(美國(guó)Sigma公司)；2,6-二叔丁基對(duì)甲苯酚(BHT，分析純)(阿拉丁試劑有限公司)；牛血清蛋白(美國(guó)Amersco公司)；考馬斯亮藍(lán)G-250、溴化鉀(KBr)(美國(guó)Fluka公司)；葡聚糖(Dextran)標(biāo)準(zhǔn)品(T-10、T-40、T-50、T-70、T-500、T-2000)(美國(guó)Pharmacia公司)；單糖標(biāo)準(zhǔn)品(L-巖藻糖Fuc、鼠李糖Rha、D-阿拉伯糖Ara、D-半乳糖Gal、D-葡萄糖Glc、D-木糖Xyl、D-甘露糖Man、D-果糖Fru、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖醛酸GlcA)(美國(guó)Sigma公司)；氯仿、正丁醇、咔唑、苯酚、水楊酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-220 SE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；2 L立式冷凍干燥機(jī)(美國(guó)LABCONCO公司)；TU-1900雙光束紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Nicolet 5700傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo公司)；Dionex ICS 5000離子色譜儀(美國(guó)Dionex公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent Technologies公司)；JSM6701F場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀(日本電子株式會(huì)社)；多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 HCP的提取

稱量粉碎后的魚腥草200 g，用95%乙醇浸泡過夜，過濾后烘干。將已經(jīng)脫脂處理的魚腥草按照料液比1:20加入超純水，置于恒溫水浴鍋中在95℃條件下攪拌2 h，將過濾后的濾渣重新提取1次，合并兩次濾液于55℃減壓濃縮至原體積的1/5，再加入乙醇沉淀12 h(使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%)，離心收集多糖沉淀物。多糖復(fù)溶后加入Sevag試劑脫蛋白4次[10](多糖溶液：Sevage試劑=4:1；Sevage試劑=氯仿:正丁醇=4:1 v/v)。除有機(jī)溶劑后把多糖溶液裝進(jìn)孔徑為8 000～14 000 Da透析袋中，用自來(lái)水、蒸餾水和超純水分別透析24 h以去除小分子物質(zhì)。最后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)多糖溶液對(duì)其進(jìn)行濃縮處理，真空冷凍干燥后獲得魚腥草精制多糖。

1.3.2 基本理化性質(zhì)的測(cè)定

計(jì)算多糖得率，按公式(1)：多糖得率/%=(多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100%

(1)

分別用苯酚-硫酸法[11]、硫酸-咔唑法[12]和考馬斯亮藍(lán)法[13]測(cè)定HCP中的中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 光譜特性分析

紫外光譜特性分析：將HCP配制成0.1 mg-1的溶液，以去離子水為空白對(duì)照，采用TU-1900紫外分光光度計(jì)于200～800 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描。

紅外光譜特性分析：蘸取微量HCP粉末，在干燥條件下與溴化鉀(KBr)混合研磨并壓制成透光薄片，以KBr作空白對(duì)照，使用Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀在400～4 000 cm-1波數(shù)下進(jìn)行掃描[14]。

1.3.4 分子量測(cè)定

通過高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)鑒定HCP的純度并測(cè)定其相對(duì)分子量[15]。將HCP溶解在含0.02%疊氮鈉水溶液中，配制1 mg·mL-1的多糖樣品，過0.22 μm水系濾膜后經(jīng)Agilent 1260色譜儀進(jìn)行測(cè)定。使用不同分子量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(T-10、T-40、T-50、T-70、T-500、T-2000)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)分子量與洗脫時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件：配有示差檢測(cè)器(RID)和紫外檢測(cè)器(DAD2996)，色譜柱為UltrahydrogelTM線性凝膠柱(300 mm×7.8 mm)。流動(dòng)相為0.02% NaN3水溶液，柱溫箱和示差檢測(cè)器溫度均為35 ℃，流速保持在0.6 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.5 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法測(cè)定魚腥草多糖的單糖組成[16]。前處理：精密稱量5 mg魚腥草多糖粉末到20 mL具塞試管中，在低溫條件下緩慢加入12 mol·L-1的濃硫酸0.5 mL，在磁力攪拌器下攪拌30 min之后加入2.5 mL超純水，在100 ℃的條件下油浴3 h進(jìn)行水解處理，待冷卻稀釋一定倍數(shù)后過0.22 μm水系濾膜，進(jìn)樣分析。選取10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(L-巖藻糖Fuc、鼠李糖Rha、D-阿拉伯糖Ara、D-半乳糖Gal、D-葡萄糖Glc、D-木糖Xyl、D-甘露糖Man、D-果糖Fru、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖醛酸GlcA)配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品，作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

離子色譜條件：配有脈沖安培檢測(cè)器(PDA)，色譜柱為CarboPacTMPA20保護(hù)柱(3 mm×150 mm)和CarboPacTMPA20分析柱(3 mm×30 mm)串聯(lián)使用。流動(dòng)相分別是250 mM NaOH溶液(A)、1 M NaOAc溶液(B)和超純水(C)，流速為0.5 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，按照一定的梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫。梯度洗脫程序如表1所示：

表1 離子色譜法梯度洗脫程序表

1.3.6 SEM分析

將HCP固體復(fù)溶后配成1.0 mg-1水溶液，重新冷凍干燥成疏松結(jié)構(gòu)后，蘸取微量于導(dǎo)電膠上，進(jìn)一步進(jìn)行噴金處理提高導(dǎo)電性，使用JSM6701F場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡于2000×，10 000×倍數(shù)下對(duì)樣品進(jìn)行掃描觀察其形貌特征。

1.3.7 抗氧化活性研究

1.3.7.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

參照Chen等[17]的實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行略微修改來(lái)測(cè)定HCP對(duì)DPPH自由基的清除能力。方法：采用BHT為陽(yáng)性對(duì)照組，配置一定濃度梯度(0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mg-1)的多糖和BHT樣品溶液，加入DPPH(0.1 mmol·L-1)試劑，混勻后于37 ℃恒溫箱中避光反應(yīng)30 min，取200 μL溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀在517 nm下測(cè)定其吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。用式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

A1：0.2 mL樣品溶液+0.5 mL DPPH

A2：0.2 mL樣品溶液+0.5 mL 95%乙醇

A0：0.2 mL去離子水+0.5 mL DPPH

清除率/%=(A0-A1+A2)/A0×100%

(2)

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品對(duì)照組吸光度。

1.3.7.2 對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力

參照Bi等[18]測(cè)定方案并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整來(lái)測(cè)定HCP對(duì)·OH的清除能力。方法：以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照組，配置一定濃度梯度(0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mg·mL-1)的多糖和BHT樣品溶液，依次加入硫酸亞鐵(FeSO4，9 mmol·L-1)和過氧化氫(H2O2，6 mmol·L-1)溶液混勻后，在37℃避光反應(yīng)10 min，然后加入水楊酸(9 mmol·L-1)繼續(xù)在37 ℃避光反應(yīng)30 min，待反應(yīng)完全之后吸取200 μL溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀在510 nm下測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。用式(3)計(jì)算·OH清除率。

A1：0.2 mL樣品溶液+0.2 mL FeSO4+0.2 mL H2O2+0.2 mL水楊酸

A2：0.2 mL樣品溶液+0.2 mL FeSO4+0.2 mL去離子水+0.2 mL水楊酸

A0：0.2 mL去離子水+0.2 mL FeSO4+0.2 mL H2O2+0.2 mL水楊酸

清除率/%=(A0-A1+A2)/A0×100%

(3)

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品對(duì)照組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 得率和基本理化性質(zhì)分析

HCP凍干后是易溶于水的褐色疏松固體。如表2所示，由本實(shí)驗(yàn)室提取的HCP的得率約為2.79%，與前人的文獻(xiàn)報(bào)道相比較低，原因可能是脫蛋白四次會(huì)損耗部分糖液，從而降低提取率?；A(chǔ)理化數(shù)據(jù)顯示，HCP的總糖含量達(dá)到了91.6%(中性糖含量和糖醛酸含量的總和)，糖醛酸的含量達(dá)到51.11%，蛋白質(zhì)含量為3.16%，說(shuō)明該多糖為酸性多糖且可能含部分結(jié)合蛋白。

表2 HCP的得率和基本理化性質(zhì)

2.2 光譜特性分析

將HCP在紫外檢測(cè)器工作波長(zhǎng)200～800 nm掃描后，其紫外光光譜圖如圖1所示，發(fā)現(xiàn)HCP在280 nm波長(zhǎng)左右處有蛋白質(zhì)吸收的特征峰，說(shuō)明該糖含有蛋白質(zhì)成分。通過紅外光譜掃描法可初步解析多糖的特征官能團(tuán)構(gòu)成。觀察圖2可知：3 356 cm-1處有較寬的強(qiáng)吸收峰是-OH的伸縮振動(dòng)，屬于糖類的特征吸收峰。多糖中甲基類的-CH伸縮振動(dòng)吸收峰在2 933 cm-1左右處有吸收。1 427 cm-1處的吸收應(yīng)該是糖類的-CH變角振動(dòng)產(chǎn)生的。上述三個(gè)峰為多糖共有的吸收峰，由此可確定其為多糖[19]。1 743～1 631 cm-1附近的吸收可能為羧基中的C=O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，也是糖醛酸的特征吸收峰[20]。800～1 200 cm-1之間的區(qū)域被稱為碳水化合物的指紋區(qū)域，給樣品的結(jié)構(gòu)差異提供了良好指示。1 100～1 018 cm-1之間的強(qiáng)吸收應(yīng)為C-O和C-O-C的伸縮振動(dòng)，為吡喃糖環(huán)吸收峰[21]。900～700 cm-1為糖類的環(huán)振動(dòng)吸收區(qū)，其在828 cm-1的弱吸收可能為α-D-半乳吡喃糖或β-D-阿拉伯吡喃糖的特征吸收峰[22]。上述紅外光譜圖分析結(jié)果表明HCP是一種綴合蛋白的果膠類酸性多糖，且具有吡喃糖結(jié)構(gòu)。

2.3 純度及分子量分析

HPGPC法是按照高聚物分子量的尺寸以及大小進(jìn)行逐級(jí)分離的，分子量大的高聚物先出峰，而分子量小的高聚物后出峰。HCP的HPGPC見圖3，觀察發(fā)現(xiàn)其在10～16 min之內(nèi)只有單峰出現(xiàn)且對(duì)稱性較好，由此得知HCP為純度較高的均一組分。圖中多糖洗脫時(shí)間是12.791 min，依據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程計(jì)算得到HCP的重均相對(duì)分子量為3.87×105Da。

2.4 單糖組成分析

混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品和HCP水解樣品的離子色譜圖見圖4，分析可知該多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸這8種單糖組成，經(jīng)計(jì)算得其物質(zhì)的量比為6.44：

8.98：16.32：10.32：3.32：1.80：39.12：1.00。如表3所示，經(jīng)酸水解的HCP樣品中，半乳糖醛酸的含量最高，為15.57%，其次是半乳糖和葡萄糖，也再次驗(yàn)證了HCP為酸性的果膠類多糖。HCP經(jīng)水解后的糖含量顯著低于常規(guī)化學(xué)方法測(cè)定的糖含量，因?yàn)樵摲椒ú荒芡耆珜CP水解為單糖，可能是由于糖醛酸之間的糖苷鍵更加難以斷裂[23]。

表3 HCP的單糖組成

2.5 SEM分析

掃描電鏡主要是根據(jù)電子束與試樣表面物質(zhì)相互作用產(chǎn)生效應(yīng)，并放大樣品結(jié)構(gòu)圖像從而獲得樣品的形貌信息，可作為表征多糖性質(zhì)的一種定性工具[24]。HCP在掃描電鏡下被放大2 000和10 000倍的固態(tài)形貌如圖5所示，由圖可知其主骨架為條桿狀物質(zhì)，部分絲狀物質(zhì)相互纏繞成非均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，還有少量球狀物質(zhì)通過細(xì)絲附著桿狀物質(zhì)表面，使HCP呈現(xiàn)蓬松質(zhì)輕的表觀形態(tài)。

2.6 抗氧化活性分析

DPPH自由基在醇溶液中穩(wěn)定存在時(shí)呈現(xiàn)紫色，遇到抗氧化物時(shí)可使DPPH自由基孤對(duì)電子被配對(duì)而導(dǎo)致溶液變成淡黃色[25]，這是評(píng)價(jià)抗氧化程度的典型指標(biāo)之一。HCP清除DPPH自由基的能力如圖6所示，當(dāng)HCP質(zhì)量濃度在0.1～0.8 mg-1范圍內(nèi)時(shí)，多糖質(zhì)量濃度與DPPH自由基的清除能力幾乎呈現(xiàn)正比例上升狀態(tài)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg-1時(shí)，HCP清除DPPH自由基的能力接近峰值達(dá)到87.18%，與BHT的清除效率基本相當(dāng)，說(shuō)明HCP對(duì)DPPH自由基的清除效果強(qiáng)。HCP的清除自由基的作用機(jī)制可能是多糖的某些功能基團(tuán)可與自由基相互作用，終止相應(yīng)的自由基鏈反應(yīng)，形成穩(wěn)定的聚合物分子，起到抗氧化保護(hù)作用[26]。

·OH是一種具有很強(qiáng)的得電子能力且其活性僅次于氟的活性氧自由基，它可以穿過細(xì)胞膜作用于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物分子引起氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡從而引發(fā)衰老等各種疾病[27]。因此，清除有害的·OH可以保護(hù)機(jī)體正常生命活動(dòng)。HCP對(duì)·OH的清除效果見圖7，由圖可知HCP質(zhì)量濃度與清除·OH的效率呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，清除率隨著劑量的增加而上升。當(dāng)HCP濃度為0.1 mg-1時(shí)，對(duì)·OH清除效率較低為7.46%。當(dāng)HCP質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg-1時(shí)，對(duì)·OH的清除率上升至31.37%，但是與BHT對(duì)照組相比，其抗氧化能力相對(duì)較弱。HCP的抗氧化作用機(jī)理可能是多糖鏈上可產(chǎn)生游離的氫原子，然后與·OH結(jié)合生成水，從而達(dá)到清除·OH作用；也有可能是多糖中的糖醛酸與Fe2+產(chǎn)生耦合作用從而抑制自由基產(chǎn)生，提高還原力[28]。

3 結(jié)論

天然產(chǎn)物來(lái)源多糖的結(jié)構(gòu)與功能研究在食品、保健品以及藥品等領(lǐng)域已經(jīng)成為一大熱點(diǎn)[29]，特別是來(lái)源豐富的食源性多糖具有良好的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景?，F(xiàn)代研究證實(shí)HCP具有消炎鎮(zhèn)痛、抗病毒和腸道保護(hù)等活性功能[30]，因此其基本結(jié)構(gòu)特征的研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法并經(jīng)脫蛋白處理后從魚腥草中提取出水溶性多糖并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了比較全面的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCP是一種重均相對(duì)分子量為3.87×105Da的均一酸性果膠類多糖，且總糖含量高達(dá)91.62%(其中糖醛酸含量為51.11%，中性糖含量為40.51%)。HCP的單糖組成主要為半乳糖醛酸和半乳糖，主要由絲狀、桿狀和球狀物質(zhì)組成，并且對(duì)DPPH自由基和·OH呈現(xiàn)較好的清除效果。本研究可為后續(xù)深入探究HCP精細(xì)結(jié)構(gòu)信息和活性功能奠定了一定的基礎(chǔ)，有利于魚腥草資源的綜合利用與開發(fā)。