安 鵬,鄭榮兒,吳佳敏,許益鵬,俞曉平

(中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 30018)

自1993年科學(xué)家首次在秀麗線蟲樣本中發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)以來,至今已在多種動植物和病毒中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種miRNA,而在人體內(nèi)也已發(fā)現(xiàn)700多種miRNA[1-2]。miRNA是一類長約21～25 nt的非編碼RNA,對控制基因表達(dá)與調(diào)控至關(guān)重要[3]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA幾乎與所有的細(xì)胞生命活動有關(guān),能通過抑制基因表達(dá)或降解mRNA來調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、凋亡和分化等過程[1,4-5]。在人體不同病理?xiàng)l件下,相關(guān)miRNA表達(dá)量會發(fā)生特定的變化,使得miRNA成為疾病診斷和預(yù)后的重要臨床標(biāo)志物之一,目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、血液疾病和心血管疾病等相關(guān)研究中[6-8]。miRNA的檢測方法很多,包括原位雜交、微陣列、流式細(xì)胞、定量實(shí)時(shí)PCR等,其優(yōu)缺點(diǎn)不一,然而miRNA在人的血液中含量甚微,獲得高濃度、高質(zhì)量的miRNA是進(jìn)行研究的第一步,也是關(guān)鍵的一步[9-10]。

傳統(tǒng)的miRNA提取方法無法滿足研究的要求,現(xiàn)在常用的miRNA提取方法有芯片法、旋轉(zhuǎn)柱法和磁珠法等[11-13]。磁珠法是近年來新興的一種核酸提取方法,具有高效性、特異性等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于miRNA提取的研究。目前,市面上有很多不同類型用于核酸提取的納米磁珠,這些磁珠的大小、修飾官能團(tuán)和生產(chǎn)工藝都有所不同,導(dǎo)致它們核酸提取性能也有很大的差異[14]。除磁珠本身因素的影響外,miRNA提取過程中磁珠用量、裂解液pH等對提取效果也有很大的影響,具體的影響情況又會因磁珠的不同而不同[15]。因此,本研究主要以人標(biāo)準(zhǔn)血清為樣本,以Promega磁珠法血清miRNA提取試劑盒為對照,比較研究了三種不同品牌的磁珠在不同磁珠用量和不同裂解液pH條件下的miRNA提取性能。最后建立的一套用于miRNA提取的體系,其提取性能與Promega試劑盒相近,能夠替代Promega試劑盒用于臨床科研,大大降低了科研成本。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑與藥品

蛋白酶K(Bio-Rad,US)、Tris(Sigma,DE)、MgCl2(Bio-Rad,US)、HCl(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、異硫氰酸胍(Sigma,DE)、異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、KCl(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、裂解液(實(shí)驗(yàn)室配制)、結(jié)合液(實(shí)驗(yàn)室配制)、清洗液1(實(shí)驗(yàn)室配制)、清洗液2(實(shí)驗(yàn)室配制)、無核酸酶水、Maxwell RSC miRNA Plasma and Exosome kit(Promega,US)。

1.2 儀 器

QuantStudio 5型qPCR儀(ThermoFisher,US)、Dynamag-2磁力架(ThermoFisher,US)、Maxwell核酸自動提取儀(Promega,US)、PCR儀(ThermoFisher,US)、勻速振蕩儀(杭州奧盛儀器有限公司)、電動移液器(Integra,CH)、干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)、pH計(jì)(MettlerToledo,CH)。

1.3 樣 本

人標(biāo)準(zhǔn)血清,購于公司羅氏(Roche,CH,cat:S5519),于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 納米磁珠

1)LGC磁珠(LGC,UK);2)PuriMag磁珠(廈門普睿邁格生物科技有限公司);3)為度磁珠(WD,蘇州為度生物科技有限公司)。

1.5 miRNA的提取

1.5.1 核酸手動提取法

1)試劑準(zhǔn)備:裂解液(主要成分為6 mol/L的異硫氰酸胍),結(jié)合液(主要成分為99%的異丙醇),清洗液1(主要成分為70%的乙醇和1%的硫代甘油),清洗液2(主要成分為75%的乙醇);

2)樣品準(zhǔn)備:將-80 ℃保存的標(biāo)準(zhǔn)血清解凍備用;

3)裂解:取1.5 mL無核酸酶離心管,向其中加入200 μL裂解液、200 μL血清樣本、1 μL(800 U/mL)蛋白酶K,振蕩均勻,56 ℃孵育10 min;

4)結(jié)合:向上述裂解樣品中加入適量磁珠工作液,振蕩均勻后再加入400 μL結(jié)合液,置于勻速振蕩儀1 500 r/min振蕩4 min;

5)洗滌:將離心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器吸去溶液,取下離心管,加入400 μL清洗液1,1 500 r/min振蕩2 min;

6)洗滌:將離心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器吸去溶液。取下離心管,加入400 μL清洗液2,1 500 r/min振蕩2 min;

7)將離心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器吸去溶液,保持管蓋敞開,靜置3 min,晾干磁珠;

8)洗脫:從磁力架上取下離心管,向管中加入50 μL無核酸酶水或TE(Tris-EDTA)緩沖液,1 500 r/min振蕩4 min;

9)將離心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器將管中提取到的RNA溶液轉(zhuǎn)移到新的無核酸酶離心管中,于-80 ℃保存或直接進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 核酸自動提取法

取血清樣本200 μL,按照Maxwell RSC miRNA Plasma and Exosome kit(Promega,US)試劑盒說明書,使用Maxwell核酸提取儀(Promega,US),自動提取miRNA,洗脫體積50 μL。

1.6 miRNA的檢測

1.6.1 檢測靶標(biāo)及引物序列

miRNA-363在標(biāo)準(zhǔn)血清中表達(dá)穩(wěn)定,故本研究選擇miRNA-363做為檢測靶標(biāo),反轉(zhuǎn)錄引物、qPCR引物序列如表1,均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 引物名稱及序列

1.6.2 miRNA的反轉(zhuǎn)錄

將磁珠法提取得到的miRNA樣本反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系(15 μL)為:H2O 2 μL,RT-primer(1 μmol/L)1.5 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.5 μL,MgCl2(50 mmol/L)1.5 μL,5x RT-Buffer 3 μL,RTase 0.5 μL,RNA樣本5 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為:25 ℃ 10 min,30 ℃ 10 min,35 ℃ 10 min,40 ℃ 10 min,95 ℃ 5 min。

1.6.3 qPCR檢測

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣本用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測,反應(yīng)體系(15 μL)為:H2O 4.65 μL,Xtensa(10 x)1.5 μL,MgCl2(50 mmol/L)0.75 μL,KlearTaq 0.1 μL,qPCR-Primer(1 μmol/L)3 μL,cDNA 5 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 min,40 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 40 s,95 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。

1.7 提取體系的優(yōu)化

1.7.1 磁珠量對miRNA提取的影響

按上述實(shí)驗(yàn)方法,檢測和比較磁珠使用量分別為10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL和40 μL時(shí)對miRNA提取的影響,根據(jù)熒光實(shí)時(shí)定量PCR的Ct值(Cycle Threshold)的變化分析不同磁珠的適用量范圍。Ct值的大小由樣本中提取到核酸模板拷貝數(shù)決定,提取得到的模板量越多,Ct值則越小,則提取性能越好。

1.7.2 裂解液pH對miRNA提取的影響

按上述實(shí)驗(yàn)方法,用HCl和NaOH調(diào)節(jié)裂解液的pH,檢測和比較在裂解液pH分別為4.8、6.4、7.2、8.0和9.0時(shí)對磁珠提取miRNA的影響,根據(jù)Ct值的變化分析最適的裂解液pH條件。

2 結(jié) 果

2.1 磁珠的選擇

構(gòu)建miRNA提取體系選用的三種不同品牌的磁珠,其材料、密度、粒徑大小等都有所不同(表2)。三種磁珠都是Fe3O4磁珠,其中LGC和PuriMag磁珠修飾官能團(tuán)都為硅羥基,WD磁珠的修飾官能團(tuán)則為羧基,PuriMag磁珠的密度相對LGC和WD磁珠密度更大。WD磁珠與LGC磁珠和PuriMag磁珠相比,粒徑更小。

表2 三種品牌磁珠的比較

2.2 提取體系的構(gòu)建

1)磁珠用量對miRNA提取效果的影響

裂解液pH均為7.4時(shí),在同樣的檢測樣本量條件下,三種磁珠在不同磁珠使用量條件下提取效率表現(xiàn)不同(圖1)。當(dāng)使用量范圍為30～40 μL時(shí),不同磁珠提取所得miRNA qPCR檢測的Ct值前后差異不大,是三種不同磁珠較適宜的工作量范圍。當(dāng)磁珠使用量為30 μL時(shí),LGC和WD磁珠的Ct值分布為28.65和28.58,相比于PuriMag磁珠的Ct值30.15具有顯著性差異(利用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,P值分別為0.03、0.026,P≤0.05),這說明與PuriMag磁珠相比,LGC和WD磁珠的提取性能更好。

圖1 三種磁珠不同用量條件下的Ct值Figure 1 Ct values of three magnetic beads at different dosages

2)裂解液pH值對miRNA提取效果的影響

當(dāng)磁珠用量均為30 μL,在同樣的檢測樣本量條件下,在不同裂解液pH條件下,3種不同磁珠的提取效率也表現(xiàn)出一定的差異(如圖2)。裂解液pH值太大或太小都會嚴(yán)重影響磁珠的提取性能,pH值在7.0～9.0之間是3種磁珠提取體系較適宜的酸堿工作范圍,當(dāng)pH值為8.0時(shí),三種磁珠的qPCR的Ct值皆最小,說明此時(shí)對miRNA的提取效率最高,LGC和WD磁珠的提取效率相比PuriMag磁珠略高,但沒有顯著性差異。

圖2 三種磁珠在裂解液不同pH條件下的Ct值Figure 2 Ct value of the three magnetic beads under different pH conditions

3)3種磁珠提取體系性能的比較

在3種磁珠最適的磁珠用量(30 μL)、pH(8.0)條件下提取相同量的樣本,多次重復(fù),并與對照組Promega試劑盒提取結(jié)果進(jìn)行比較,如圖3所示,LGC、PuriMag、WD三種磁珠體系以及對照組Promega平均Ct值分別為27.83、28.25、27.5和27.15。利用SPSS顯著性差異分析(t檢驗(yàn)),LGC、PuriMag與Promega有顯著性差異(t檢驗(yàn)的P值分別為0.037、0.028,P≤0.05),表明LGC、PuriMag與Promega相比具有明顯差距。而WD磁珠提取體系提取miRNA的效率與對照組Promega試劑盒組相比,二者沒有顯著性差異,提取性能相當(dāng)。這說明WD磁珠提取體系提取miRNA的效率在3種磁珠提取體系中最高,可以替代Promega試劑盒提取試劑盒。

注:每組實(shí)驗(yàn)6次重復(fù)

3 討 論

本研究在傳統(tǒng)的核酸提取理論基礎(chǔ)的上,以納米磁珠為核心構(gòu)建了一套用于miRNA提取的體系,并主要探討了磁珠用量和裂解液pH對磁珠體系miRNA提取性能的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,磁珠的規(guī)格、磁珠用量和裂解液pH對體系提取性能影響明顯。市面上有很多不同品牌的磁珠,因其生產(chǎn)方法、原料及生產(chǎn)工藝等的不同,磁珠的直徑、修飾官能團(tuán)、密度也都不同。磁珠的直徑越小,磁珠的比表面積越大,有利于對miRNA的吸附;但磁珠太小卻不利于與磁棒的結(jié)合,在提取過程中流失較多,從而導(dǎo)致提取結(jié)果不夠理想。在本研究中,LGC和PuriMag磁珠的修飾官能團(tuán)都為硅羥基,但是在相同條件下,密度更小的LGC磁珠的miRNA提取效率明顯要比PuriMag磁珠高(圖1,圖2)。WD磁珠的修飾基團(tuán)不同于另外兩種磁珠,其磁珠粒徑更小(表1),在最適合的磁珠用量和pH條件下,對miRNA提取的效率最高。實(shí)驗(yàn)選取的3種磁珠構(gòu)建體系后提取miRNA效果不同,但單獨(dú)分析3種磁珠直徑對miRNA提取效果沒有明顯的趨勢,可能跟小粒徑的磁珠更容易吸附蛋白有關(guān),導(dǎo)致效果區(qū)分不明顯。

修飾官能團(tuán)則主要影響磁珠與核酸分子間的結(jié)合力,不同官能團(tuán)與核酸分子的結(jié)合力不同,例如氨基修飾的磁珠更容易與帶負(fù)電的核酸分子結(jié)合,而羧基修飾的磁珠則需要鹽溶液環(huán)境的外部驅(qū)動力來吸附核酸[14]。在本研究中,密度相同但修飾官能團(tuán)不同的WD磁珠和LGC磁珠對miRNA提取效率相比于PuriMag磁珠更為接近,不能反映出硅羥基和羧基這兩種修飾官能團(tuán)對miRNA提取效率的區(qū)別。本研究中的三個(gè)磁珠體系均是在pH范圍7.0～9.0之間時(shí)效果較好,在pH為8.0時(shí)提取效率最高,說明此時(shí)的pH值比較適合三種磁珠的修飾官能團(tuán)(硅羥基/羧基)對miRNA的吸附,市面上有很多不同官能團(tuán)修飾的磁珠,例如還有氨基、巰基等官能團(tuán)修飾的磁珠,它們適宜的pH范圍就有所不同,氨基修飾的磁珠適宜pH范圍為7.5～9,而巰基官能團(tuán)修飾的磁珠適宜pH范圍為5.8～7[15]。此外,實(shí)驗(yàn)pH條件可能會影響裂解液對樣本的裂解效果,從而影響核酸的釋放量,最終影響提取效率[16]。

本研究以人標(biāo)準(zhǔn)血清為樣本,用熒光定量PCR檢測靶標(biāo)miRNA-363,以Ct值的大小來評估3種不同磁珠提取體系的性能,還存在著很多的不足,評估的指標(biāo)需要進(jìn)一步的豐富。研究團(tuán)隊(duì)接下來會繼續(xù)對提取體系進(jìn)行優(yōu)化,包括對磁珠的篩選、試劑體系鹽濃度和成分等的進(jìn)一步的調(diào)整,并在后續(xù)中給予分析和介紹。