樊雨梅，帖航，張筱梒，史傳超，蘇寧，廖峰*

（1.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東 聊城 252201；2.東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

畜禽骨作為肉制品加工行業(yè)的主要副產(chǎn)物，約占動物體重的20%～30%[1]。據(jù)統(tǒng)計，2018年我國肉類總產(chǎn)量為8 624.63萬噸[2]，約產(chǎn)生1 725萬噸～2 587萬噸畜禽骨，這些畜禽骨處理不當(dāng)將會給環(huán)境和經(jīng)濟(jì)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。對畜禽骨進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，生產(chǎn)增值的原料或產(chǎn)品，不僅提高了畜禽骨的價值，而且還避免了環(huán)境污染。但是，目前我國畜禽骨大多被丟棄或用于制骨湯或加工低價值產(chǎn)品（骨粉、骨泥等），深加工利用率很低[3]。因此，高價值利用畜禽骨成為當(dāng)今主要的研究內(nèi)容。

針對畜禽骨的研究主要集中在膠原蛋白和生物活性肽的提取工藝優(yōu)化、產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用、功效研究，目的是將畜禽骨用作功能性食品、化妝品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的高附加值原料。大量的研究表明，利用蛋白酶水解得到的畜禽骨生物活性肽具有多種生物活性功能，比如抗骨質(zhì)疏松[4-5]、降血壓[6-7]、抑菌[8-9]、抗疲勞[10-11]、抗氧化[12-13]和促進(jìn)傷口愈合[14-15]等。我國是家驢主產(chǎn)國之一[16]，但是目前對畜禽骨開發(fā)集中在豬[17]、牛[18]、牦牛[19]、羊[20]、鹿[21]、雞[22]等畜禽骨，對驢骨的開發(fā)利用研究較少。驢骨作為我國的傳統(tǒng)藥物有著廣泛的藥用記載，動物骨骼藥效可能與所含有的骨膠原、軟骨素等活性成分有關(guān)，為精準(zhǔn)提取獨特的驢骨生物活性肽，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF/MS）方法分析驢骨蛋白質(zhì)組成，并通過基因本體論（gene ontology，GO）分類法對檢測到的蛋白質(zhì)進(jìn)行歸類，揭示驢骨蛋白生物學(xué)功能，為今后驢骨生物活性肽的提取及功能研究提供一定的理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢骨：山東天龍驢產(chǎn)業(yè)研究院；乙腈、甲醇、甲酸（均為質(zhì)譜純）：百靈威科技有限公司；Tris-base：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、尿素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、考馬斯亮藍(lán)R-250（生物級）、十二烷基硫酸鈉：北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；兩性電解質(zhì)緩沖液（Bio-Lyte 3-10，20%）、固相化pH梯度（immoblized pH gradients，IPG）膠條（ready strip，7 cm，pH 3-10）、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）maker：美國Bio-Rad公司；測序級胰蛋白酶（70 U/mg蛋白）：普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀（Autoflex speed）：美國Bruker Daltonics公司；SDS-PAGE電泳儀（Mini Protean 3 Cell）、2-DE 電泳儀（Protean IEF cell）：美國 Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 驢骨素樣品的制備

防疫檢驗、微生物檢驗合格的鮮骨，經(jīng)破碎、蒸煮提取、過濾、濃縮、噴霧干燥后，制成驢骨素樣品。精密稱取制備的驢骨素粉末10.000 0 g，加入100 mL pH 8.0含100 mmol/L氯化鈉的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，在80℃下浸提60 min，待樣品冷卻至室溫25℃后，10 000 r/min離心30 min，取中間層澄清溶液，即為10%待測驢骨素溶液。

1.3.2 蛋白質(zhì)特性的測定

1.3.2.1 BCA法測定蛋白質(zhì)含量

按照BCA蛋白濃度測定試劑盒上的方法檢測驢骨膠原蛋白的蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.2 SDS-PAGE電泳測定蛋白質(zhì)分子量范圍

根據(jù)帕爾哈提·柔孜等[23]的方法稍作修改。10%驢骨膠原蛋白溶液稀釋10倍后，加入等量的含DTT的2×上樣緩沖液，充分混勻，沸水浴5 min。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠12%。上樣量為10 μL，將凝膠掃描電子圖譜保存，電泳所用的marker分子量范圍在10 kDa～250 kDa。

1.3.2.3 二維電泳分析蛋白質(zhì)等電點范圍

方法參考文獻(xiàn)[24]，略有改動。200 μL 10%驢骨膠原蛋白溶液與800 μL的水化液混勻。取200 μL加載到電泳池，等點聚焦程序見表1。

表1 7 cm膠條的IEF程序Table 1 IEF program for 7 cm latex

等電聚焦后立即進(jìn)行膠條平衡。平衡分兩步，每次15 min，分別使用5 mL含1%DTT平衡液和5 mL含2.5%碘代乙酰胺平衡液。將平衡好的膠條放置于濃度為12%聚丙烯酰胺凝膠上，并用1%的瓊脂糖固定膠條，進(jìn)行第二向電泳。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色后，以脫色液脫去背景顏色，使用凝膠成像設(shè)備掃描成電子圖片保存。

1.3.3 蛋白質(zhì)組成的分析

驢骨膠原蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，將條帶對半切開，轉(zhuǎn)移至EP管中。蛋白質(zhì)的脫色酶切方法參考文獻(xiàn)[25]。濃縮液與基質(zhì)混合后，采用MALDI-TOF/TOF-MS分析。利用Mascot軟件的SwissPort數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。檢索分類（Taxonomy）為 Equus caballus，Mascot檢索 p＜0.05 和 Mascot得分＞41分的結(jié)果被認(rèn)為鑒定成功。

1.3.4 利用GO法對蛋白進(jìn)行歸類

通過GO法對以檢測蛋白質(zhì)分別以其分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）和細(xì)胞組成（cell component，CC）3 種方式進(jìn)行歸類，揭示驢骨素蛋白生物學(xué)功能。再對驢骨素蛋白進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，尋找驢骨素蛋白集中的生物學(xué)信號通路。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以3次重復(fù)試驗每次同時做平行試驗所得的數(shù)據(jù)為結(jié)果，用均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)

2.1.1 蛋白質(zhì)含量的分析

利用BCA法測定驢骨素蛋白的蛋白質(zhì)含量為47.82 g/100 g，小于劉楚怡等[26]報道的驢骨膠原蛋白含量57.3 g/100 g，可能是由于凱氏定氮法主要測定的是樣品中總氮含量才導(dǎo)致的結(jié)果偏高。

2.1.2 蛋白質(zhì)分子量的分布

利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測驢骨素蛋白的分子量分布見圖1。

圖1 驢骨膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of donkey bone extract

由圖1可知，驢骨素蛋白分子量在10 kDa～250 kDa之間呈彌散性分布，與馬國霞等[27]、張崟等[28]報道的豬骨素蛋白電泳條帶一致，可能是由于加工過程中蛋白質(zhì)降解降解程度偏低，沒有形成清晰的條帶導(dǎo)致的。因驢骨素加工過程中一般使用高溫蒸煮，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解不徹底，使蛋白質(zhì)分子呈彌散型。

2.1.3 蛋白質(zhì)等電點

驢骨素的2-DE電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 驢骨素蛋白2-DE電泳結(jié)果Fig.2 2-DE of donkey bone extract

由圖2可知，水平方向為第一固相pH梯度等點聚焦，垂直向為第二向垂直板SDS-PAGE電泳，驢骨素蛋白的等電點主要集中在4.5～6.5之間，說明驢骨素蛋白結(jié)構(gòu)中的酸性氨基酸及中性氨基酸較多。驢骨素也有微量蛋白質(zhì)在堿性區(qū)域。

2.2 蛋白質(zhì)組成的分析

利用SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS的方法，總共鑒定出89種蛋白質(zhì)，其中有21種未命名蛋白，剩余68種蛋白分析結(jié)果見表2。

表2 驢骨素蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果Table 2 Analysis of components in donkey bone extract protein

續(xù)表2 驢骨素蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果Continue table 2 Analysis of components in donkey bone extract protein

2.3 蛋白質(zhì)GO分類和KEGG通路分析結(jié)果

利用在線生物信息數(shù)據(jù)庫DAVID（http：//david.ncifcrf.gov，6.7版本）對驢骨素所含有的89種蛋白進(jìn)行GO分類，結(jié)果見圖3。

從細(xì)胞組成分析可知，驢骨素蛋白參與的細(xì)胞組分主要是角蛋白纖維（GO：0045095）、外泌體（GO：0070062）、血液微粒（GO：0072562）、膠原三聚體（GO：0005581）、細(xì)胞體 （GO：0044297）、絲狀體（GO：0030175）、核小體（GO：0000786）、細(xì)胞周邊（GO：0071944）、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（GO：0005578）、細(xì)胞核（GO：0005634）、片狀偽足（GO：0030027）、細(xì)胞外區(qū)域（GO：0005615）、核小體（GO：0000788）、I型膠原三聚體（GO：0005584）、致密體（GO：0097433）、肌節(jié)（GO：0030017）、鈣通道復(fù)合體（GO：0034704）。

驢骨素蛋白參與的生物過程主要包括間充質(zhì)遷移（GO：0090131）、膠原原纖維組織（GO：0030199）、氨基酸刺激的細(xì)胞反應(yīng)（GO：0071230）、核小體組裝（GO：0006334）、視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)（GO：0001895）、基因表達(dá)的正調(diào)控（GO：0010628）、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性的正調(diào)控（GO：0051343）、環(huán)核苷酸代謝過程的正調(diào)控（GO：0030801）、軟骨內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生中的軟骨發(fā)育（GO：0060351）、丹參堿敏感性鈣釋放通道活性的正向調(diào)控（GO：0060316）、骨骼肌細(xì)絲組件（GO：0030240）、毛發(fā)周期（GO：0042633）、中間絲細(xì)胞骨架組織（GO：0045104）、角化作用（GO：0031424）、皮膚形態(tài)發(fā)生（GO：0043589）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)螯合鈣離子向細(xì)胞質(zhì)釋放（GO：0010880）、鈣離子的識別（GO：0005513）、衰老（GO：0007568）、磷蛋白磷酸酶活性的正向調(diào)節(jié)（GO：0032516）、蛋白質(zhì)異源三聚（GO：0070208）等。

圖3 驢骨素蛋白GO分類結(jié)果Fig.3 GO classification of protein in donkey bone extract

驢骨素蛋白參與的生物過程分子功能主要是結(jié)構(gòu)分子活性（GO：0005198）、核小體DNA結(jié)合（GO：0031492）、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：0005201）、蛋白磷酸酶激活劑活性（GO：0072542）和氧結(jié)合（GO：0019825）。

對驢骨素蛋白進(jìn)行KEGG的生物通路富集分析，以推斷它們參與的信號通路，結(jié)果見圖4。

圖4 驢骨素蛋白KEGG生物通路富集分析結(jié)果Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of protein in donkey bone extract

驢骨素蛋白主要參與信號通路包括血小板激活（ecb04611）、黏附斑（ecb04510）、酒精中毒（ecb05034）、蛋白質(zhì)的消化與吸收（ecb04974）、ECM受體相互作用（ecb04512）、阿米巴?。╡cb05146）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（ecb05322）、血管平滑肌收縮（ecb04270）、催產(chǎn)素信號通路（ecb04921）、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)（ecb05202）、PI3KAkt信號通路（ecb04151）、肥厚性心肌?。╡cb05410）、Rap1信號通路（ecb04015）和擴(kuò)張型心肌病（ecb05414）。其中，PI3K-Akt信號通路是胰島素發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其任何一個環(huán)節(jié)異常均會干擾胰島素的生理功能，進(jìn)而導(dǎo)致2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[29]。相關(guān)研究也證實[30]，Rap1信號通路參與糖尿病腎病的發(fā)生。這些研究成果從分子生物學(xué)角度解釋了《本草綱目》中關(guān)于驢骨“牝驢骨煮汁服，治多年消渴，極效”的記載。

3 結(jié)論

本文旨在研究驢骨素蛋白質(zhì)的性質(zhì)和組成，為提取具有特征生理活性的驢骨生物活性肽提供理論依據(jù)。采用SDS-PAGE、二維電泳和MALDI-TOF/TOF/MS等手段揭示驢骨素蛋白的性質(zhì)與組成，并通過GO分類法對檢測到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類，同時，對驢骨素蛋白進(jìn)行KEGG信號通路富集分析。研究表明，驢乳粉蛋白質(zhì)的含量為47.82 g/100 g，分子量在10 kDa～250 kDa間呈彌散型分布，等電點均勻分布在4.5～6.5之間。通過與馬科蛋白圖庫進(jìn)行對比，共識別出89種蛋白。利用GO分類法對89種蛋白質(zhì)進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)驢骨素蛋白主要參與構(gòu)成的細(xì)胞組分包括角蛋白纖維、外泌體、血液微粒、膠原三聚體、細(xì)胞體、絲狀體等，參與的生物過程主要包括間充質(zhì)遷移、膠原原纖維組織、氨基酸刺激的細(xì)胞反應(yīng)、核小體組裝、視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)、基因表達(dá)的正調(diào)控、軟骨內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生中的軟骨發(fā)育等，參與的分子功能包括結(jié)構(gòu)分子活性、核小體DNA結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、蛋白磷酸酶激活劑活性和氧結(jié)合。KEGG的生物通路富集分析結(jié)果顯示驢骨素蛋白主要參與了血小板激活、黏附斑、蛋白質(zhì)的消化與吸收等14條信號通路，其中PI3K-Akt信號通路和Rap1信號通路的識別從分子機(jī)制角度解釋了驢骨治療糖尿病的可能機(jī)制。這些研究成果為驢骨素生物活性肽的提取和功能研究提供了一定的理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。