超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛組織中常山酮?dú)埩袅?/h1>
2021-01-28 02:47:42
食品研究與開(kāi)發(fā) 2021年2期
（漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462300）
常山酮（halofuginone）屬于人工合成的一種廣譜抗球蟲(chóng)藥，是一種從植物常山中分離出來(lái)的常山堿的鹵代衍生物[1]，其氫溴酸鹽治療效果較好、副作用較少，且不易產(chǎn)生交叉耐藥性，被廣泛用來(lái)防治畜禽的球蟲(chóng)病[2-3]。常山酮主要在肝臟進(jìn)行代謝，在組織中降解較快[4]，孫曉娟等[5]、吳寧鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)常山酮的休藥期為5 d，為此，在用藥過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行其休藥期，確保動(dòng)物性食品的安全[7]。目前，常山酮在畜禽養(yǎng)殖上已大量使用，因此，建立可靠的牛組織中常山酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法，科學(xué)推測(cè)其休藥期，保證食品安全顯得尤為重要。
目前，常山酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法主要包括液相色譜法[8-11]、酶聯(lián)免疫法[12-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]等。在動(dòng)物性食品中，常山酮?dú)埩袅繖z測(cè)的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[17-18]均為液相色譜法。依據(jù)GB 29693—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中常山酮?dú)埩袅康臏y(cè)定高效液相色譜法》和SN 0643—1997《出口肉及肉制品中溴氯常山酮?dú)埩袅繖z驗(yàn)方法》，動(dòng)物性食品中的常山酮?dú)埩袅康臋z測(cè)定量限均為50μg/kg，而GB31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》[19]中要求牛組織中常山酮?dú)埩粝蘖繛?0 μg/kg～30 μg/kg，因此，采用GB 29693—2013和SN 0643—1997對(duì)牛組織中常山酮的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，其定量限均無(wú)法達(dá)到牛組織中常山酮?dú)埩粝蘖康臉?biāo)準(zhǔn)要求，本試驗(yàn)對(duì)牛組織中常山酮?dú)埩袅康那疤幚矸椒ㄟM(jìn)行了優(yōu)化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，以期解決牛組織樣品中常山酮?dú)埩粝蘖康?，?guó)家相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)定量限達(dá)不到殘留限量標(biāo)準(zhǔn)要求的問(wèn)題，將其用于牛組織、雞組織等不同基質(zhì)樣品中常山酮?dú)埩袅康目焖俣ㄐ院投俊?/p>
1 材料與方法
1.1 主要儀器
Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、JLSPE-12B型固相萃取裝置：Waters公司；BSA224S型電子天平、ML802E型電子天平：Mettler Toledo公司；GL-21M型離心機(jī)：湘儀離心機(jī)有限公司；VX-III型多管平行振蕩器：Targin公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置：Eyela公司；5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。
1.2 試劑和材料
除非另有說(shuō)明，分析中僅使用分析純的試劑，水為符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水；氫溴酸常山酮對(duì)照品（含量≥99.6%）：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；牛肉、牛肝樣品：市售；Oasis HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL）：Waters公司；尼龍濾膜（0.22 μm）：天津津騰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；乙酸銨、冰乙酸（均為優(yōu)級(jí)純）：上海國(guó)藥集團(tuán)；甲醇、乙酸乙酯、甲酸銨、甲酸（均為色譜純）、乙腈（質(zhì)譜純）：Fisher公司。
1.3 主要溶液配制
1.3.1 0.25 mol/L乙酸銨緩沖液
稱(chēng)取19.27 g乙酸銨用水溶解于1 000 mL容量瓶中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1 000 mL，用冰乙酸調(diào)pH值至4.3。
準(zhǔn)確量取150 mL乙腈、445 mL水和5 mL冰乙酸，再加入1.73 g乙酸銨，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.3.3 20 mg/mL胰蛋白酶溶液
準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g胰蛋白酶，用水溶解并定容至1 000 mL。
1.3.4 200 μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液
準(zhǔn)確稱(chēng)取氫溴酸常山酮對(duì)照品10.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用0.25 mol/L乙酸銨緩沖液溶解并稀釋至刻度。2℃～8℃避光保存，有效期6個(gè)月。
1.3.5 2.0 μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液
準(zhǔn)確吸取200 μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。2℃～8℃避光保存，有效期3個(gè)月。
有時(shí)再談得遠(yuǎn)一點(diǎn)，就是表姊表妹之類(lèi)訂了婆家，或是什么親戚的女兒出嫁了。或是什么耳聞的，聽(tīng)說(shuō)的，新娘子和新姑爺鬧別扭之類(lèi)。
1.4 儀器條件
1.4.1 液相色譜條件
色譜柱：WatersBEH-C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨），B相為乙腈；流速：0.45 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40℃；流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1。
表1 常山酮流動(dòng)相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase and gradient elution conditions of halofuginone
1.4.2 質(zhì)譜條件
電離模式：電噴霧正離子（ESI+）模式；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；干燥氣流量：900 L/Hr；干燥氣溫度：450℃；錐孔反吹氣流量：40 L/Hr；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）模式，監(jiān)測(cè)條件如表2所示[20]。
表2 常山酮的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件Table 2 Multi-reaction monitoring（MRM）conditions of halofuginone
1.5 樣品處理
1.5.1 樣品提取
稱(chēng)取試樣（4.00±0.04）g于50 mL離心管中，加入10 mL 20 mg/mL胰蛋白酶溶液，渦動(dòng)1 min，用10%碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8.0，渦旋混勻后于40℃水浴中酶解3 h。取出，放至室溫（20±5）℃，加入10%碳酸鈉溶液2 mL，渦動(dòng)1 min，再加入乙酸乙酯20 mL，于多管平行振蕩器上振蕩5 min，0℃離心機(jī)中放置3 min，0℃環(huán)境中2000r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)入100mL蒸餾瓶中，下層液用乙酸乙酯20 mL重復(fù)提取一次，合并兩次上清液[17-18]。上清液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，殘余物中加入0.125 mol/L乙酸銨緩沖溶液10 mL和水飽和正己烷10 mL，于超聲波提取器中振蕩提取1 min，轉(zhuǎn)入另一50mL離心管中，7000r/min離心5min，收集下層水相，備用。
1.5.2 樣品凈化
HLB柱依次用 3 mL甲醇、3 mL水和 3 mL 0.125 mol/L乙酸銨緩沖液活化，取全部備用液過(guò)柱，用3 mL水淋洗柱子；最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用1.0 mL流動(dòng)相（1.3.2）溶解殘余物，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。
1.5.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制
精密吸取2.0 μg/mL的常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇溶解并稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0 mL，分別加至經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試樣洗脫液中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用1.0 mL流動(dòng)相（1.3.2）溶解殘余物，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。
2 結(jié)果與討論
2.1 樣品處理的優(yōu)化
試樣按1.5.1酶解并經(jīng)乙酸乙酯提取后，若采用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液反萃取，在乙酸銨緩沖液中會(huì)溶解少量乙酸乙酯，導(dǎo)致樣品凈化時(shí)在上樣過(guò)程中，少量乙酸乙酯將常山酮部分洗脫，從而影響檢測(cè)回收率。本試驗(yàn)中，樣品酶解并經(jīng)乙酸乙酯提取后，采用旋蒸至干，然后用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液復(fù)溶，消除了乙酸乙酯對(duì)常山酮的洗脫，從而提高了檢測(cè)的回收率。
試驗(yàn)表明：采用HLB固相萃取柱凈化上樣，當(dāng)乙酸銨緩沖液中不含乙酸乙酯時(shí)，常山酮的回收率為90%以上；當(dāng)乙酸銨緩沖液中含5%乙酸乙酯時(shí)，常山酮的回收率降至40%左右；當(dāng)乙酸銨緩沖液中含10%乙酸乙酯時(shí)，常山酮基本無(wú)回收。經(jīng)優(yōu)化，本試驗(yàn)采用將乙酸乙酯旋蒸至干后，再用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液溶解殘?jiān)?，并用水飽和正己烷除脂肪，以確保凈化上樣過(guò)程中無(wú)乙酸乙酯殘留，從而大大提高檢測(cè)回收率。
為減少基質(zhì)效應(yīng)，保證檢測(cè)回收率，本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，優(yōu)化后樣品處理方法見(jiàn)1.5。
2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器條件的優(yōu)化
2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
在電噴霧離子源正離子（ESI+）模式下，常山酮易得到H+形成較為穩(wěn)定的[M+H]+的分子離子。本試驗(yàn)采用100 ng/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描和子離子掃描，獲得常山酮的母離子掃描圖（圖1）和特征碎片離子掃描圖（圖2），并對(duì)其毛細(xì)管電壓、碎裂電壓和碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇離子豐度最強(qiáng)的碎片離子對(duì)為定量離子對(duì)，離子豐度相對(duì)較強(qiáng)的離子對(duì)為定性離子對(duì)，優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件。
2.2.2 液相條件的優(yōu)化
本試驗(yàn)采用BEH-C18色譜柱對(duì)常山酮進(jìn)行分離，以乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，對(duì)比了水、0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）作為流動(dòng)相中的水相對(duì)常山酮的峰型和靈敏度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)水相中加入微量甲酸時(shí)，常山酮的靈敏度顯著提高，而加入微量甲酸銨時(shí)，目標(biāo)物的峰型變得尖銳對(duì)稱(chēng)，所以最終選用0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）作為水相。經(jīng)優(yōu)化，最終選用1.4.1中液相條件對(duì)常山酮進(jìn)行洗脫，采用優(yōu)化后液相條件測(cè)定的1 ng/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖和定量離子色譜圖如圖3所示。
2.3 線(xiàn)性方程和定量限
按1.5.3中的常山酮標(biāo)準(zhǔn)系列配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4中建立的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。以測(cè)定峰面積Y對(duì)含量X（ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其回歸方程為Y=18 283.5X+203.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，得到常山酮的檢出限為 0.25 μg/kg，定量限為 0.5 μg/kg。
圖1 常山酮的母離子掃描圖Fig.1 The parent ion scan of halofuginone
圖2 常山酮的特征碎片離子掃描圖Fig.2 The fragment ions scan of halofuginone
圖3 1 ng/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖和定量離子色譜圖Fig.3 The total ion chromatogram and quantitative ion chromatogram of 1 ng/mL halofuginone
2.4 加標(biāo)回收率和精密度
取處理均勻的牛肉和牛肝樣品，按表3設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果表明，牛組織中常山酮的回收率為73.2%～93.60%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為5.91%～7.96%，具體結(jié)果如表3所示。
表3 牛組織中常山酮的回收率和精密度結(jié)果Table 3 The standard recovery and precision of halofuginone in bovine tissues
3 結(jié)論
本試驗(yàn)建立了牛組織中常山酮?dú)埩袅康某咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，樣品經(jīng)胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。本方法具有檢測(cè)快速、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、雜峰干擾小、檢出限低等特點(diǎn)，適用于牛組織中常山酮?dú)埩袅康臏?zhǔn)確定性和定量。
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目前，常山酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法主要包括液相色譜法[8-11]、酶聯(lián)免疫法[12-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]等。在動(dòng)物性食品中，常山酮?dú)埩袅繖z測(cè)的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[17-18]均為液相色譜法。依據(jù)GB 29693—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中常山酮?dú)埩袅康臏y(cè)定高效液相色譜法》和SN 0643—1997《出口肉及肉制品中溴氯常山酮?dú)埩袅繖z驗(yàn)方法》，動(dòng)物性食品中的常山酮?dú)埩袅康臋z測(cè)定量限均為50μg/kg，而GB31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》[19]中要求牛組織中常山酮?dú)埩粝蘖繛?0 μg/kg～30 μg/kg，因此，采用GB 29693—2013和SN 0643—1997對(duì)牛組織中常山酮的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，其定量限均無(wú)法達(dá)到牛組織中常山酮?dú)埩粝蘖康臉?biāo)準(zhǔn)要求，本試驗(yàn)對(duì)牛組織中常山酮?dú)埩袅康那疤幚矸椒ㄟM(jìn)行了優(yōu)化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，以期解決牛組織樣品中常山酮?dú)埩粝蘖康?，?guó)家相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)定量限達(dá)不到殘留限量標(biāo)準(zhǔn)要求的問(wèn)題，將其用于牛組織、雞組織等不同基質(zhì)樣品中常山酮?dú)埩袅康目焖俣ㄐ院投俊?/p>
1 材料與方法
1.1 主要儀器
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1.2 試劑和材料
除非另有說(shuō)明，分析中僅使用分析純的試劑，水為符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水；氫溴酸常山酮對(duì)照品（含量≥99.6%）：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；牛肉、牛肝樣品：市售；Oasis HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL）：Waters公司；尼龍濾膜（0.22 μm）：天津津騰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；乙酸銨、冰乙酸（均為優(yōu)級(jí)純）：上海國(guó)藥集團(tuán)；甲醇、乙酸乙酯、甲酸銨、甲酸（均為色譜純）、乙腈（質(zhì)譜純）：Fisher公司。
1.3 主要溶液配制
1.3.1 0.25 mol/L乙酸銨緩沖液
稱(chēng)取19.27 g乙酸銨用水溶解于1 000 mL容量瓶中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1 000 mL，用冰乙酸調(diào)pH值至4.3。
準(zhǔn)確量取150 mL乙腈、445 mL水和5 mL冰乙酸，再加入1.73 g乙酸銨，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.3.3 20 mg/mL胰蛋白酶溶液
準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g胰蛋白酶，用水溶解并定容至1 000 mL。
1.3.4 200 μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液
準(zhǔn)確稱(chēng)取氫溴酸常山酮對(duì)照品10.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用0.25 mol/L乙酸銨緩沖液溶解并稀釋至刻度。2℃～8℃避光保存，有效期6個(gè)月。
1.3.5 2.0 μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液
準(zhǔn)確吸取200 μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。2℃～8℃避光保存，有效期3個(gè)月。
有時(shí)再談得遠(yuǎn)一點(diǎn)，就是表姊表妹之類(lèi)訂了婆家，或是什么親戚的女兒出嫁了。或是什么耳聞的，聽(tīng)說(shuō)的，新娘子和新姑爺鬧別扭之類(lèi)。
1.4 儀器條件
1.4.1 液相色譜條件
色譜柱：WatersBEH-C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨），B相為乙腈；流速：0.45 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40℃；流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1。
表1 常山酮流動(dòng)相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase and gradient elution conditions of halofuginone
1.4.2 質(zhì)譜條件
電離模式：電噴霧正離子（ESI+）模式；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；干燥氣流量：900 L/Hr；干燥氣溫度：450℃；錐孔反吹氣流量：40 L/Hr；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）模式，監(jiān)測(cè)條件如表2所示[20]。
表2 常山酮的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件Table 2 Multi-reaction monitoring（MRM）conditions of halofuginone
1.5 樣品處理
1.5.1 樣品提取
稱(chēng)取試樣（4.00±0.04）g于50 mL離心管中，加入10 mL 20 mg/mL胰蛋白酶溶液，渦動(dòng)1 min，用10%碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8.0，渦旋混勻后于40℃水浴中酶解3 h。取出，放至室溫（20±5）℃，加入10%碳酸鈉溶液2 mL，渦動(dòng)1 min，再加入乙酸乙酯20 mL，于多管平行振蕩器上振蕩5 min，0℃離心機(jī)中放置3 min，0℃環(huán)境中2000r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)入100mL蒸餾瓶中，下層液用乙酸乙酯20 mL重復(fù)提取一次，合并兩次上清液[17-18]。上清液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，殘余物中加入0.125 mol/L乙酸銨緩沖溶液10 mL和水飽和正己烷10 mL，于超聲波提取器中振蕩提取1 min，轉(zhuǎn)入另一50mL離心管中，7000r/min離心5min，收集下層水相，備用。
1.5.2 樣品凈化
HLB柱依次用 3 mL甲醇、3 mL水和 3 mL 0.125 mol/L乙酸銨緩沖液活化，取全部備用液過(guò)柱，用3 mL水淋洗柱子；最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用1.0 mL流動(dòng)相（1.3.2）溶解殘余物，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。
1.5.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制
精密吸取2.0 μg/mL的常山酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇溶解并稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0 mL，分別加至經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試樣洗脫液中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用1.0 mL流動(dòng)相（1.3.2）溶解殘余物，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。
2 結(jié)果與討論
2.1 樣品處理的優(yōu)化
試樣按1.5.1酶解并經(jīng)乙酸乙酯提取后，若采用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液反萃取，在乙酸銨緩沖液中會(huì)溶解少量乙酸乙酯，導(dǎo)致樣品凈化時(shí)在上樣過(guò)程中，少量乙酸乙酯將常山酮部分洗脫，從而影響檢測(cè)回收率。本試驗(yàn)中，樣品酶解并經(jīng)乙酸乙酯提取后，采用旋蒸至干，然后用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液復(fù)溶，消除了乙酸乙酯對(duì)常山酮的洗脫，從而提高了檢測(cè)的回收率。
試驗(yàn)表明：采用HLB固相萃取柱凈化上樣，當(dāng)乙酸銨緩沖液中不含乙酸乙酯時(shí)，常山酮的回收率為90%以上；當(dāng)乙酸銨緩沖液中含5%乙酸乙酯時(shí)，常山酮的回收率降至40%左右；當(dāng)乙酸銨緩沖液中含10%乙酸乙酯時(shí)，常山酮基本無(wú)回收。經(jīng)優(yōu)化，本試驗(yàn)采用將乙酸乙酯旋蒸至干后，再用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液溶解殘?jiān)?，并用水飽和正己烷除脂肪，以確保凈化上樣過(guò)程中無(wú)乙酸乙酯殘留，從而大大提高檢測(cè)回收率。
為減少基質(zhì)效應(yīng)，保證檢測(cè)回收率，本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，優(yōu)化后樣品處理方法見(jiàn)1.5。
2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器條件的優(yōu)化
2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
在電噴霧離子源正離子（ESI+）模式下，常山酮易得到H+形成較為穩(wěn)定的[M+H]+的分子離子。本試驗(yàn)采用100 ng/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描和子離子掃描，獲得常山酮的母離子掃描圖（圖1）和特征碎片離子掃描圖（圖2），并對(duì)其毛細(xì)管電壓、碎裂電壓和碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇離子豐度最強(qiáng)的碎片離子對(duì)為定量離子對(duì)，離子豐度相對(duì)較強(qiáng)的離子對(duì)為定性離子對(duì)，優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件。
2.2.2 液相條件的優(yōu)化
本試驗(yàn)采用BEH-C18色譜柱對(duì)常山酮進(jìn)行分離，以乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，對(duì)比了水、0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）作為流動(dòng)相中的水相對(duì)常山酮的峰型和靈敏度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)水相中加入微量甲酸時(shí)，常山酮的靈敏度顯著提高，而加入微量甲酸銨時(shí)，目標(biāo)物的峰型變得尖銳對(duì)稱(chēng)，所以最終選用0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）作為水相。經(jīng)優(yōu)化，最終選用1.4.1中液相條件對(duì)常山酮進(jìn)行洗脫，采用優(yōu)化后液相條件測(cè)定的1 ng/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖和定量離子色譜圖如圖3所示。
2.3 線(xiàn)性方程和定量限
按1.5.3中的常山酮標(biāo)準(zhǔn)系列配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4中建立的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。以測(cè)定峰面積Y對(duì)含量X（ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其回歸方程為Y=18 283.5X+203.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，得到常山酮的檢出限為 0.25 μg/kg，定量限為 0.5 μg/kg。
圖1 常山酮的母離子掃描圖Fig.1 The parent ion scan of halofuginone
圖2 常山酮的特征碎片離子掃描圖Fig.2 The fragment ions scan of halofuginone
圖3 1 ng/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖和定量離子色譜圖Fig.3 The total ion chromatogram and quantitative ion chromatogram of 1 ng/mL halofuginone
2.4 加標(biāo)回收率和精密度
取處理均勻的牛肉和牛肝樣品，按表3設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果表明，牛組織中常山酮的回收率為73.2%～93.60%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為5.91%～7.96%，具體結(jié)果如表3所示。
表3 牛組織中常山酮的回收率和精密度結(jié)果Table 3 The standard recovery and precision of halofuginone in bovine tissues
3 結(jié)論
本試驗(yàn)建立了牛組織中常山酮?dú)埩袅康某咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，樣品經(jīng)胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。本方法具有檢測(cè)快速、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、雜峰干擾小、檢出限低等特點(diǎn)，適用于牛組織中常山酮?dú)埩袅康臏?zhǔn)確定性和定量。
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