楊彪，魏新鎖，趙曉光，李卓，王瑤

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院a.骨科， b.檢驗科，西安 710077)

骨肉瘤(osteosarcoma)是兒童和青少年常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，主要侵犯長管狀骨，惡性程度高，發(fā)展迅速，死亡率高，嚴重威脅著患者的健康和生命[1]。因此，研究骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找有效的早期診斷指標及治療靶點具有重要的臨床意義。

外泌體(exosome)是納米級脂質(zhì)包涵體，包裹轉(zhuǎn)運多種物質(zhì)，如環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA(long non coding RNA，LncRNA)和信使RNA等[2]，主要通過細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用[3]。外泌體可以在血液、唾液和乳汁等體液中被釋放，不僅可以調(diào)節(jié)受體細胞的功能，還可以作為疾病診斷的生物學(xué)標志物[4]。近年來，有關(guān)外泌體來源的LncRNA在腫瘤中的功能得到廣泛研究，外泌體LncRNA H19的生物學(xué)功能和分子機制也得到進一步的認識[5]。本研究旨在通過分析骨肉瘤患者血清外泌體中LncRNA H19的表達水平，為進一步探討骨肉瘤的發(fā)生機理及相關(guān)靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2016年3月至2019年10月于西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科及腫瘤科診治的骨肉瘤患者46例作為病例組，男性29例，女性17例，年齡13～32歲。納入標準:(1)所有研究對象均經(jīng)骨科及腫瘤科專家聯(lián)合確診；(2)無放、化療等抗癌治療史。排除標準：(1)合并其他腫瘤者；(2)有心臟病、器官衰竭、精神障礙、高血壓、糖尿病、創(chuàng)傷性疾病和免疫疾病的患者；(3)合并其他心、腎、肝臟功能不全者。收集同期就診的50例無骨腫瘤病史的體檢健康者作為健康人對照組，男性30例，女性20例，年齡為15～28歲。本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(No.XYFYEC2016022),各研究對象均知情同意。

1.2主要試劑與儀器 外泌體RNA 提取試劑盒、QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國Qiagen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR實時熒光定量試劑盒(北京諾博萊德公司)，PCR引物(蘇州金唯智公司)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子2(IGF-2) ELISA檢測試劑盒(武漢默沙克生物科技公司)。CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，NanoDrop ND-1000UV微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)，Multiskan FC型酶聯(lián)儀(上海賽默飛世爾儀器公司)，NICOMP 380粒徑分析儀(美國PSS公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集各研究對象的空腹靜脈血4 mL(骨肉瘤患者于手術(shù)前采集，體檢健康者于體檢時采集)，置于含分離膠的促凝采血管中，2 h內(nèi)4 ℃、3 000×g離心10 min，4 h內(nèi)完成MMP-9、VEGF、IGF-2的ELISA法檢測，剩余血清加入至無RNase的Ep管中，置于-80 ℃保存。

1.3.2血漿外泌體RNA的提取及其效率評價 按照exoRNeasy試劑盒說明書提取外泌體。簡化步驟如下:樣品于4 ℃、10 000×g離心2次，每次30 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新Ep管中，加入0.5倍體積的PBS稀釋，再加入0.05倍體積蛋白酶K溶液，37 ℃溫育15 min；而后加入0.3倍總體積的外泌體分離試劑，4 ℃溫育2 h，10 000×g離心20 min，取沉淀即為外泌體。提取外泌體采用2種方法評價：(1)經(jīng)4 mL PBS重懸，置于NICOMP380粒徑分析儀進行粒徑分析；(2)通過檢測外泌體常見的特異性標志蛋白——白細胞分化抗原63(cluster of differentiation 63,CD63)和CD81作為外泌體純度的指標。步驟：提取的外泌體用100 μL PBS復(fù)勻，加入20 μL熒光直標抗體CD63或CD81溫育，以不染色為空白對照，流式細胞儀檢測并統(tǒng)計分離的外泌體陽性百分比，用以判斷外泌體的純度。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA樣本用DEPC溶液稀釋10倍，置于-20 ℃保存。

1.3.4實時熒光定量PCR 根據(jù)GenBank中的LncRNA H19及β-actin的基因序列號(分別為NM_001293171.2、NM_001101.3)，用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并由蘇州金唯智公司合成。LncRNA H19上游引物序列:5′-TGCTGCACTTTACAACCACG-3′，下游引物序列:5′-ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小為182 bp；β-actin上游引物序列:5′-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3′，下游引物序列:5′-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小為129 bp。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括：10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，SYBR Rremix Ex TaqⅡ(2×)12.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45個循環(huán)；72 ℃時采集熒光信號，使用7500 System Software-SDS 2.2軟件進行熔解曲線分析，檢測PCR產(chǎn)物的特異性。每孔均設(shè)3個復(fù)孔，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算LncRNA H19的表達水平，公式:△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參照。

1.3.5ELISA法測定血清MMP-9、VEGF、IGF-2水平 采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明書操作，使用Multiskan FC型酶聯(lián)儀在450 nm波長處讀取吸光度(A)值，采用標準曲線法計算各標本濃度。血清MMP-9、VEGF、IGF-2的參考范圍分別為：MMP-9≤1 137.65 pg/mL、VEGF≤293.62 pg/mL、IGF-2≤0.76 pg/mL。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用ROC曲線評價LncRNA H19對骨肉瘤的篩查價值。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清外泌體提取效率的評價 提取的外泌體經(jīng)NICOMP 380粒徑分析儀分析，證實分布粒徑在20～200 nm范圍內(nèi)的樣品占8%以上，與外泌體的粒徑分布相吻合，其平均粒徑及主峰均在外泌體粒徑范圍內(nèi)，粒子的分布系數(shù)在0.07～0.8之間，表明體系分數(shù)適中，檢測置信度高。各血清外泌體提取物經(jīng)熒光染色后均呈陽性，CD63和CD81的陽性率均在70%以上，證實所提取物為外泌體。

2.2血清外泌體LncRNA H19水平與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)關(guān)系 將血清外泌體LncRNA H19的表達水平與骨肉瘤患者性別、年齡、居住地、發(fā)病部位、AJCC分期及是否遠處轉(zhuǎn)移進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清外泌體LncRNA H19的表達水平與腫瘤分期及是否遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.01)，而與患者性別、年齡、居住地及發(fā)病部位均無顯著關(guān)系(P均>0.05)，見表1。

表1 血清外泌體LncRNA H19表達水平與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3外泌體LncRNA H19和血清MMP-9、VEGF、IGF-2檢測結(jié)果 骨肉瘤組患者外泌體LncRNA H19和血清MMP-9、VEGF、IGF-2的表達水平均顯著高于健康人對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，見表2。

表2 各組血清外泌體LncRNA H19和血清MMP-9、VEGF、IGF-2含量檢測結(jié)果

2.4外泌體LncRNA H19、血清MMP-9、VEGF、IGF-2檢測對骨肉瘤的篩查價值 以骨肉瘤組為疾病組，以健康人對照組為對照組，繪制ROC曲線評估各項指標篩查骨肉瘤的篩查效能，結(jié)果表明LncRNA H19的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.881(95%CI：0.835～0.947)，當cut-off值為0.395時，其篩查骨肉瘤的敏感性為87.2%，特異性為75.6%；外泌體LncRNA H19、血清MMP-9、VEGF、IGF-2聯(lián)合檢測的AUCROC為0.932(95%CI：0.886～0.978)，敏感性為92.5%，特異性為86.2%，均高于3項指標的單獨篩查價值，見表3、圖1。

圖1 外泌體LncRNA H19、血清MMP-9、VEGF、IGF-2篩查骨肉瘤的ROC曲線

表3 各項指標篩查骨肉瘤的效能評價

3 討論

近年來，LncRNA被報道參與了骨肉瘤的發(fā)生過程。有證據(jù)表明，LncRNA H19不僅參與骨肉瘤的發(fā)生，而且在細胞遷移和腫瘤侵襲的過程中發(fā)揮重要的作用[5]。Luo等[6]發(fā)現(xiàn)LncRNA H19在腫瘤組織中的表達水平明顯高于鄰近的癌旁組織，且LncRNA H19陽性細胞比例較高的患者具有更高的癌癥轉(zhuǎn)移風(fēng)險。Li等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19可以海綿樣吸附于miR-200，從而抑制miR-200的抑制作用，最終促進骨肉瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。此外，亦有研究表明，LncRNA H19的表達水平與骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移距離及侵襲能力呈正相關(guān)[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LncRNA H19通過誘導(dǎo)NF-κB通路，并激活PI3K/AKT信號通路,調(diào)控VEGF等因子的表達，從而導(dǎo)致骨肉瘤的遷移和入侵[9]。另有研究證實，LncRNA H19通過競爭性結(jié)合miR-200，上調(diào)ZEB1和ZEB2，進而誘導(dǎo)骨肉瘤細胞的侵襲，從而促進轉(zhuǎn)移[7]。本研究結(jié)果顯示，血清外泌體中LncRNA H19在骨肉瘤中的表達水平與患者的性別、年齡、居住地及發(fā)病部位均無顯著相關(guān)(P均>0.05)，而與骨肉瘤患者的臨床分期及是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.01)，這提示LncRNA H19可能成為篩查骨肉瘤的生物學(xué)標志物。

Yang等[10]研究表明，Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1, Yap1)過表達促進了Runx2和骨鈣素的表達，而Runx2是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。另有研究證實，Runx2調(diào)控了MMP-9和VEGF的表達，原因可能與腫瘤轉(zhuǎn)移過程有關(guān)[11]。IGF2和LncRNA H19在大多數(shù)正常人體組織中均有印跡，但在腫瘤中印跡往往缺失。IGF2和/或LncRNA H19印跡缺失常發(fā)生在癌癥中，并可能參與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化。本研究采取與骨肉瘤發(fā)生相關(guān)的MMP-9、VEGF、IGF-2因子作為研究對象，通過檢測其在骨肉瘤患者及健康人對照組中的表達，并比較LncRNA H19在骨肉瘤篩查中的作用，結(jié)果表明，骨肉瘤組外泌體可穩(wěn)定表達LncRNA H19，其表達水平顯著高于健康人對照組(P均<0.01)，且血清MMP-9、VEGF、IGF-2的敏感性和特異性也都高于健康人對照組(P均<0.01)，這提示外泌體中LncRNA H19和血清MMP-9、VEGF、IGF-2、MMP-9均可作為骨肉瘤篩查的生物學(xué)指標；血清外泌體LncRNA H19的AUCROC為0.881，其篩查骨肉瘤的敏感性為87.2%，特異性為75.6%，均高于其余各單項組，表明血清外泌體 LncRNA H19具有更高的骨肉瘤的篩查價值。

綜上所述，鑒于血清學(xué)的無創(chuàng)性特點，而MMP-9、VEGF、IGF-2等細胞因子受多種內(nèi)外因素影響較大，因此，血清外泌體LncRNA H19更適用于大量人群的篩查。LncRNA H19在骨肉瘤篩查中更具明顯的優(yōu)勢，有望成為骨肉瘤篩查、靶點個體化治療及療效監(jiān)測的生物學(xué)標志物。