潘英芳，邵靜茹，趙愛平，周娜，徐群，宋永紅

(山東省血液中心血型參比研究室，濟(jì)南250014)

當(dāng)某種血型在人群中僅有小于千分之一的人擁有時(shí)，即可認(rèn)為該血型為稀有血型[1]。當(dāng)稀有血型患者需要輸血時(shí)，一方面很可能由于相同血型在人群中出現(xiàn)的頻率十分罕見，無法及時(shí)找到相匹配的血液，另一方面由于稀有血型患者一旦產(chǎn)生相應(yīng)的稀有血型抗體，輸注血型不合的血液即可產(chǎn)生輸血反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至可致死亡。因此，稀有血型患者用血一直是臨床輸血的難題，快速、高效地篩選出相合的稀有血型血液已成為亟待解決的問題。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室一般采用傳統(tǒng)手工方法篩選稀有血型。最近我們用IH-1000全自動(dòng)血型儀篩選Fya陰性血液，并完成1例抗Fya陽性患者配血工作。

1 資料與方法

1.1對(duì)象 患者，女，47歲，圍絕經(jīng)期功能失調(diào)性子宮出血、貧血，血紅蛋白50 g/L，曾多次輸血，欲手術(shù)備血，醫(yī)院輸血科檢測(cè)不規(guī)則抗體呈陽性，送本室進(jìn)行抗體鑒定，并要求配血4 U。

1.2標(biāo)本采集與處理 由本中心專業(yè)人員采集獻(xiàn)血者血液，EDTA-K2抗凝，4 ℃保存，行常規(guī)血型檢測(cè)后冷鏈運(yùn)輸本室待篩選。

1.3主要儀器與試劑 IH-1000全自動(dòng)血型儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，KUBOTA-KA2200血清學(xué)離心機(jī)、KUBOTA-3220毛細(xì)管超速離心機(jī)(日本久保田公司)，HH-W600金壇數(shù)顯三用恒溫箱(金壇市科析儀器公司)，MC450紅細(xì)胞洗滌離心機(jī)(日本日立公司)，所有儀器均在校準(zhǔn)有效期內(nèi)使用。

單克隆抗A抗體(批號(hào)：20190917)、抗B抗體(批號(hào)：20190204)、ABO試劑紅細(xì)胞(批號(hào)：20200113)、抗C抗體(批號(hào)：20193001)、抗c抗體(批號(hào)：20183102)、抗E抗體(批號(hào)：20203201)、抗e抗體(批號(hào)：20183302)均為IgM型抗體，均購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥公司，抗D抗體(IgM型，批號(hào)：8000254001)、抗Fya抗體(IgG型，批號(hào)：8000236190)、抗Fyb抗體(IgG型，批號(hào)：8000232692)、篩選細(xì)胞(批號(hào)：8000261662)、譜細(xì)胞(批號(hào)：8000261664)均購(gòu)自荷蘭Sanquin公司，抗人球蛋白卡、樣本稀釋液均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，所有試劑均合格。

1.4免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn) ABO血型及其他特殊血型抗原鑒定、不規(guī)則抗體篩查鑒定、交叉配血均按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》及試劑盒說明書操作[2]，抗體篩查、鑒定結(jié)果均結(jié)合所用譜細(xì)胞抗原格局表判讀。

1.5稀有血型篩選

1.5.1抗體工作液選擇(參照抗體效價(jià)測(cè)定) 將抗體試劑原液倍比稀釋，在各倍比稀釋抗體的試管(微孔板、凝膠卡孔)中加入紅細(xì)胞溫育(試管法、微板法紅細(xì)胞濃度為3%～5%，體積為50 μL；凝膠卡紅細(xì)胞濃度為0.8%，體積為50 μL)，洗滌后加入抗人球蛋白試劑(微柱凝膠卡法無需此步驟)，離心觀察結(jié)果，以出現(xiàn)反應(yīng)強(qiáng)度1+且易于觀察判讀的稀釋度作為最終篩選陰性紅細(xì)胞的工作液。

1.5.2試管法、96孔微板法、微柱凝膠卡法篩選Fya陰性紅細(xì)胞 均采用抗人球蛋白試驗(yàn)方法并按試劑盒說明書操作。

1.5.3IH-1000篩選Fya陰性獻(xiàn)血者 參考IH-1000主側(cè)交叉配血程序，將抗Fya試劑按1∶64稀釋后加至貼有條形碼的試管內(nèi)，取代患者血清樣本一側(cè)；在IH-Com界面中選擇Work List，點(diǎn)擊Quick Request圖標(biāo)，在test下拉菜單中選擇自主命名的“稀有血型系統(tǒng)篩選”程序，將抗Fya試劑試管和獻(xiàn)血者樣本試管掃碼上機(jī)；開始運(yùn)行，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束，機(jī)器自行判讀結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1患者血型及其他血型系統(tǒng)表型鑒定 該患者血型為O型，Rh血型系統(tǒng)表型為CCDee，Duffy血型系統(tǒng)表型為Fy(a-b+)。

2.2患者不規(guī)則抗體篩查鑒定結(jié)果 間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,患者血清與O1～O3篩選細(xì)胞均存在不同程度的凝集，強(qiáng)度分別為0+,4+,2+s(s：strong指強(qiáng)凝集)；進(jìn)一步運(yùn)用O1～O16譜細(xì)胞與患者血清反應(yīng)存在不同凝集，格局明顯，結(jié)合患者Rh系統(tǒng)及Duffy系統(tǒng)表現(xiàn)型，推斷鑒定該患者血清內(nèi)不規(guī)則抗體為抗E、抗c合并抗Fya抗體。

2.3用IH-1000 篩選Fya陰性紅細(xì)胞 從1 500名獻(xiàn)血者血液中篩選出4名Fya陰性者，采用手工微柱凝膠法，用抗Fya抗體試劑原液進(jìn)行確認(rèn)，經(jīng)驗(yàn)證均為Fya陰性；同時(shí)確認(rèn)其Rh系統(tǒng)CcEe表現(xiàn)型,其中2例表型為CCee。

2.4主側(cè)交叉配血 用患者血清與2名Fya抗原確認(rèn)陰性且E、c抗原陰性的獻(xiàn)血者紅細(xì)胞進(jìn)行主側(cè)配血試驗(yàn)，用手工微柱凝膠法主側(cè)配血相合。

2.5IH-1000篩選Fya陰性血液方法與傳統(tǒng)方法對(duì)比 常規(guī)確認(rèn)Fya抗原采用抗Fya抗體原液，考慮到抗Fya抗體試劑成本高，對(duì)于初步篩選Fya陰性血液，首先對(duì)抗體稀釋比例進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用抗原為雜合Fy(a+b+)的紅細(xì)胞，進(jìn)行Fya抗體效價(jià)驗(yàn)證，最終以1+強(qiáng)度凝集稀釋度作為工作液條件，即經(jīng)典試管抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)法(簡(jiǎn)稱傳統(tǒng)試管法)按照稀釋比例1∶8、96孔微板抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)法(簡(jiǎn)稱96孔微板法)按照稀釋比例1∶2、微柱凝膠卡法和IH-1000均按照稀釋比例1∶64工作液進(jìn)行篩選操作,見表1。

表1 4種方法初篩所用抗Fya抗體稀釋比例

用經(jīng)典試管抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)法(簡(jiǎn)稱傳統(tǒng)試管法)、96孔板抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)法(簡(jiǎn)稱96孔微板法)、手工微柱凝膠檢測(cè)卡方法及IH-1000 4種方法預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比抗體物料消耗、人力消耗、工作效率、結(jié)果判讀難易程度等，最終選擇IH-1000方法篩選上述1 500例獻(xiàn)血者血液，見表2。

表2 4種方法篩選Fya抗原陰性血液對(duì)比

3 討論

通常將ABO以外的血型抗體稱之為不規(guī)則抗體。近年來，由于ABO、RhD抗原同型輸血已得以規(guī)范，不規(guī)則抗體誘發(fā)的輸血反應(yīng)上升為影響臨床輸血安全的重要因素。因此，輸血前行不規(guī)則抗體篩查是保障臨床輸血安全的重要措施之一[3-4]，而稀有血型系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的罕見不規(guī)則抗體雖然少見，但其誘發(fā)輸血反應(yīng)不容忽視。Duffy血型系統(tǒng)中Fya抗原陰性血液在亞洲人群中的概率約為3‰，這些罕見個(gè)體一旦產(chǎn)生相應(yīng)不規(guī)則抗體，即面臨配血困難，繼而存在延誤治療的風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。本病例存在抗c、抗E、抗Fya 3種不規(guī)則抗體，為Fya陰性稀有血型患者。本病例重度貧血,急需輸注配血相合血液，考慮到抗Fya抗體可引起速發(fā)性或者延遲性溶血性輸血反應(yīng)[8]，因此，最好選擇Fya陰性血液輸注，3種抗原同時(shí)陰性的頻率為0.6‰，需要篩選至少1 500名獻(xiàn)血者，我們面臨篩選Fya陰性稀有血型的困難。

傳統(tǒng)稀有血型篩選方法，主要分為傳統(tǒng)試管法、96孔微板法、微柱凝膠卡法，均需要手工配制紅細(xì)胞懸液，工作量大，且消耗大量抗體試劑及其他耗材，同時(shí)需對(duì)每一個(gè)標(biāo)本試管或者凝膠卡孔準(zhǔn)確標(biāo)記，讀取結(jié)果靠肉眼觀察，主觀性強(qiáng)，步驟繁雜，每步都存在誤差可能性[9-10]。近年來，一些實(shí)驗(yàn)室開展基因技術(shù)篩選稀有血型，但由于技術(shù)要求較高，涉及設(shè)備較多，經(jīng)費(fèi)較大，基因技術(shù)推進(jìn)相對(duì)緩慢[11]。為迅速準(zhǔn)確篩選到相配合的血液，我科室利用IH-1000交叉配血程序，將稀有血型篩選全自動(dòng)化。IH-1000系一款免疫血液學(xué)診斷用的全自動(dòng)系統(tǒng)，是基于免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的卡式凝膠技術(shù)，能夠處理多種免疫血液學(xué)ID-Card技術(shù)，包括ABO血型分型、抗體篩查、抗體鑒定、抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)測(cè)試和交叉配血[12-14]。IH-1000在醫(yī)院輸血科應(yīng)用較廣且應(yīng)用多年，由于臨床標(biāo)本量大，IH-1000在臨床輸血中應(yīng)用優(yōu)勢(shì)明顯，但臨床輸血科儲(chǔ)血有限，一旦遇到復(fù)雜同種抗體造成配血不合病例，多委托血站篩選血液。我實(shí)驗(yàn)室在接到此類標(biāo)本后，一般先行不規(guī)則抗體鑒定，再行抗原陰性獻(xiàn)血者篩選并配血。借助血站大量獻(xiàn)血者樣本試管儲(chǔ)備優(yōu)勢(shì)，在IH-1000交叉配血功能基礎(chǔ)上建立稀有血型程序，再對(duì)篩選的陰性獻(xiàn)血者行紅細(xì)胞相應(yīng)抗原確認(rèn)，短時(shí)間內(nèi)便從1 500名獻(xiàn)血者中為患者篩選到了c抗原、E抗原及Fya抗原均陰性的血液，與患者主側(cè)配血試驗(yàn)相合，患者因此得到及時(shí)安全的輸血治療。

經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)及實(shí)踐，本實(shí)驗(yàn)室建立的IH-1000稀有血型篩選程序，已形成比較成熟的體系程序，利用IH-1000全自動(dòng)血型儀高效、靈敏一體化優(yōu)勢(shì)，運(yùn)用較低的抗體濃度、較少的人力耗材成本、較便捷的操作即實(shí)現(xiàn)了Fya陰性血液的篩選。后續(xù)我們反復(fù)實(shí)踐，證實(shí)該程序也可以用于篩選Diego等其他血型系統(tǒng)的稀有血型血液。IH-1000篩選稀有血型程序可以在臨床輸血中推廣，便于保障臨床供血，同時(shí)可以加快我國(guó)稀有血型庫建設(shè)[15]，豐富稀有血型庫信息資源，緩解稀有血型患者用血難問題。