陳冬燕 王賀 張燦 郭建新 李明新

干眼是由多種因素引起的淚膜和眼表疾病，包括眼表不適癥狀、視力變化和淚膜不穩(wěn)定，并常常伴有潛在的眼表損傷、淚液滲透壓升高和眼表炎癥[1-2],常見的癥狀有干澀、疲勞、瘙癢感、異物感、灼痛、畏光和對外界刺激的敏感性增加等。有時由于缺乏基礎(chǔ)淚液，過度的眼干燥刺激反射性淚液分泌，導致頻繁流淚，甚至出現(xiàn)眼紅、充血和角質(zhì)化。隨著角膜上皮剝脫和炎癥的發(fā)展，可導致角膜結(jié)膜化、鱗狀上皮化生和新生血管長入，進而影響視力。

在過去十年中，玻璃體內(nèi)注射藥物成為治療濕性老年性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變合并黃斑水腫等幾種常見眼科疾病的首選方法[3-4]。這些患者往往需要頻繁的玻璃體內(nèi)給藥操作，為減少感染性眼內(nèi)炎的風險，每次注射前都必須對眼表進行無菌處理，目前國內(nèi)外幾乎所有的玻璃體內(nèi)注藥操作指南均推薦使用聚維酮碘進行手術(shù)區(qū)域的消毒[5-6]。然而我們前期研究表明，聚維酮碘本身會對角膜上皮細胞產(chǎn)生不利影響[7]。Saedon等[8]對玻璃體內(nèi)注藥后的患者進行流行病學研究結(jié)果顯示，術(shù)前應(yīng)用聚維酮碘會導致眼部不適、淚液滲透壓增加及角膜熒光素染色陽性，提示出現(xiàn)類似干眼的臨床表現(xiàn)。高頻度的聚維酮碘使用是否會導致顯著的眼表和淚膜穩(wěn)定性損傷，以及這種損傷的嚴重程度尚未被深入研究。因此，本研究首次探討了局部滴用10 g·L-1聚維酮碘對大鼠眼表結(jié)構(gòu)和淚膜穩(wěn)定性的影響，為臨床反復使用聚維酮碘致患者眼表損害的預防和治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取30只SD雄性大鼠(SPF級，6～ 8周齡，體質(zhì)量160～180 g，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。使用裂隙燈顯微鏡檢查大鼠眼前節(jié)無異常。整個研究中30只大鼠均置于標準環(huán)境中飼養(yǎng)[9]：室溫25 ℃±1 ℃，濕度60%±10%，以及交替的12 h明暗周期(早上8點到晚上8點)。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，動物實驗符合ARVO關(guān)于動物眼科和視覺研究的相關(guān)規(guī)定，同時獲得了徐州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的批準，批準號為XYFY201-KL033-07。

1.2 方法30只大鼠左眼作為對照眼為A組，右眼作為實驗眼為B組。A組使用生理鹽水滴眼，B組使用10 g·L-1聚維酮碘滴眼，均為每天2次。分別在干預前和干預后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d 觀察兩組大鼠眼的淚膜破裂時間(BUT)、淚液分泌量、角膜熒光素染色評分和炎癥指數(shù)評分，并于干預后14 d進行角膜共聚焦顯微鏡(HRTⅢ 德國海德堡公司)檢查，隨后腹腔注射過量水合氯醛處死大鼠，摘取眼球行組織病理學檢查。

1.2.1 淚液分泌量檢測所有大鼠均由同一操作者在相同時間(晚上9點)、相同地點、相同的照明強度和溫度、濕度環(huán)境下測量大鼠基礎(chǔ)淚液分泌量。固定大鼠頭部后，將下眼瞼輕輕拉下，露出結(jié)膜囊。將酚紅棉線(天津晶明)彎曲5 mm至末端，并置于下瞼中外1/3結(jié)膜囊處。15 s后，取出棉線，并測量淚液浸潤的紅色部分的長度。每眼重復測量3次取平均值。

1.2.2 BUT檢測5 μL的1 g·L-1熒光素鈉滴至大鼠結(jié)膜囊內(nèi)，使其瞬目，瞬目后熒光素均勻涂布于角膜表面，在裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察角膜染色區(qū)出現(xiàn)第一個黑斑(破裂點)的時間，記錄3次取平均值，即為BUT。

1.2.3 角膜熒光素染色評分參考Pauly等[10]報道的方法，在裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察各組大鼠角膜上皮缺損的位置及范圍。角膜熒光素染色評分標準如下：0分：沒有染色；1分：輕微的點狀著染，少于30個點；2分：點狀著染≥30個點，但沒有成片；3分：嚴重彌漫性染色，但沒有斑塊；4分：有熒光素斑塊。

1.2.4 炎癥指數(shù)評分干預后不同時間點通過裂隙燈觀察各組大鼠眼部炎癥反應(yīng)，并評估炎癥指數(shù)，標準如下：睫狀充血(0分：不存在；1分：小于1 mm；2分：1～2 mm；3分：大于2 mm)；中央角膜水腫(0分：不存在；1分：存在可見的虹膜細節(jié)；2分：存在而沒有可見的虹膜細節(jié)；3分：存在而無法窺見瞳孔)；周圍角膜水腫(0分：不存在；1分：可見虹膜細節(jié)；2分：虹膜細節(jié)不可見；3分：無法窺見虹膜)，以上參數(shù)的得分之和除以9分即為炎癥指數(shù)。

1.2.5 角膜共聚焦顯微鏡檢查所有檢查均由同一操作者進行。大鼠使用100 g·L-1水合氯醛按照2 mL·kg-1體質(zhì)量腹腔注射麻醉。水浸式物鏡表面加 2 g·L-1卡波姆眼用凝膠(美國BAUSCH &LOMB公司)，一名操作者持大鼠頭部使其固定于顯微鏡前,分開眼瞼使角膜正對物鏡中央，另一名操作者移動物鏡使其與角膜中央接近,選擇半自動掃描，待見至內(nèi)皮層時按下記錄鍵,則角膜各層的掃描圖像被自動記錄下來并存盤。使用軟件自帶的細胞計數(shù)模塊手動對角膜內(nèi)皮細胞密度進行分析。

1.2.6 組織病理學檢查于干預14 d后腹腔注射過量水合氯醛處死所有大鼠，摘除雙眼眼球，40 g·L-1多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋、切片行組織病理學檢查：所有結(jié)膜均行PAS染色觀察杯狀細胞數(shù)量及形態(tài)；隨機選取兩組各4只角膜行HE染色觀察各層組織結(jié)構(gòu)，兩組剩余角膜均行PMN/ED1雙重免疫組織化學染色觀察中性粒細胞/巨噬細胞在組織層間的浸潤情況。PMN/ED1雙重免疫組織化學染色參照文獻[11] 進行，角膜組織切片常規(guī)脫蠟至水，體積分數(shù)10%血清封閉1 h，隨后與PMN一抗(14000，F(xiàn)itzgerald公司，英國)、ED1一抗(1200，AbD Serotec公司，英國)一起孵育，使用不含任何一抗的PBS作為陰性對照。4 ℃濕房中過夜。將樣品置于常溫下復溫20 min后，傾去一抗，PBS浸洗3次，隨后加入堿性磷酸酶免疫復合物二抗(1500，F(xiàn)itzgerald公司，英國)孵育2 h，傾去二抗，PBS浸洗3次，每次5 min。加AP-Fast Red工作液，顯微鏡下觀察，當出現(xiàn)明顯的紅色顯色反應(yīng)時，PBS沖洗終止顯色反應(yīng)，隨后加入過氧化物酶免疫復合物二抗(1500，F(xiàn)itzgerald公司，英國)孵育2 h，傾去二抗，PBS浸洗3次，每次5 min。加DAB工作液，顯微鏡下觀察，當出現(xiàn)明顯的棕色反應(yīng)時，PBS沖洗終止顯色反應(yīng)。使用封片液(甘油與PBS等容積混合)封片，顯微照相系統(tǒng)下觀察，并拍照儲存。

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈檢查及角膜熒光素染色結(jié)果裂隙燈檢查結(jié)果顯示，A組使用生理鹽水滴眼14 d后，角膜透明、上皮完整，熒光素染色陰性；B組使用10 g·L-1聚維酮碘滴眼14 d后，角膜欠透明、上皮粗糙，熒光素染色陽性，呈點片狀著染(圖1)。

圖1 兩組大鼠裂隙燈檢查及角膜熒光素染色結(jié)果

2.2 各評價指標檢測結(jié)果

2.2.1 BUT干預前，A組與B組間BUT相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。干預后2 d，B組即可觀察到BUT縮短，且隨時間延長，B組BUT降低趨勢更加明顯。干預后6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，A、B兩組間BUT相比差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見圖2A)。

2.2.2 淚液分泌量A組與B組干預前和干預后2 d、4 d淚液分泌量相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05),B組干預后淚液分泌量較干預前明顯減少。干預后6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，A、B兩組間淚液分泌量相比差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見圖2B)。

2.2.3 角膜熒光素染色評分A組干預前及干預后不同時間點角膜熒光素染色均為陰性。B組干預前角膜熒光素染色陰性，但干預后2 d即可觀察到角膜點狀著染，隨時間延長，B組角膜熒光素著染區(qū)域逐漸增加，并融合成片，提示較為嚴重的角膜上皮損傷。干預后不同時間點A、B兩組間角膜熒光素染色評分差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05) (見圖2C)。

2.2.4 炎癥指數(shù)與A組相比，B組在干預后不同時間點的眼部炎癥指數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見圖2D)。B組以睫狀充血為主，在干預后期甚至出現(xiàn)輕度的角膜水腫，可能與角膜上皮損傷和炎癥細胞浸潤有關(guān)，提示聚維酮碘局部滴眼可導致角結(jié)膜組織的炎癥反應(yīng)。

圖2 兩組大鼠不同時間點各臨床指標的對比 A：BUT；B：淚液分泌量；C：角膜熒光素染色評分；D：炎癥指數(shù)。注：與A組相比，*P<0.05。

2.3 角膜共聚焦顯微鏡檢查共聚焦顯微鏡下觀察顯示，與A組相比，B組角膜上皮層可見少量高反光炎癥細胞浸潤，基質(zhì)層亦可見炎癥細胞聚集，基質(zhì)細胞數(shù)量增多，提示可能出現(xiàn)基質(zhì)細胞活化；兩組角膜內(nèi)皮細胞數(shù)量及形態(tài)大致相同(圖3)。

圖3 共聚焦顯微鏡觀察兩組角膜組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)(×800)

2.4 組織病理學檢查結(jié)果角膜HE染色結(jié)果顯示，A組角膜上皮由排列整齊的4～6層上皮細胞構(gòu)成；B組角膜上皮細胞層數(shù)增多，上皮厚度增加，基底細胞呈現(xiàn)“空泡樣”結(jié)構(gòu)，角膜厚度稍有增加，角膜表面欠光滑。結(jié)膜PAS染色結(jié)果顯示，與A組相比，B組PAS染色陽性細胞數(shù)量顯著降低，結(jié)膜上皮增厚，細胞層數(shù)增加，提示聚維酮碘局部滴眼可影響?zhàn)さ鞍椎暮铣膳c分泌，結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量顯著降低。PMN/ED1雙重免疫組織化學染色結(jié)果顯示，A組無PMN/ED1染色陽性細胞；而B組角膜上皮細胞層間可見少量PMN染色陽性細胞，基質(zhì)層，尤其是淺層基質(zhì)，可見大量PMN/ED1染色陽性細胞，提示聚維酮碘局部滴眼可誘導炎癥細胞聚集，導致明顯的角膜炎癥反應(yīng)(圖4)。

圖4 兩組組織病理學檢查結(jié)果

3 討論

近年來流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，隨著生活習慣和工作環(huán)境的改變，人們干眼的患病率逐年升高，全球各年齡段的患病率為5%～35%[12]。干眼的病因眾多，發(fā)病機制尚未完全明確，建立理想、穩(wěn)定的動物模型是研究干眼病理生理變化進而指導臨床治療的基礎(chǔ)。現(xiàn)有的干眼動物模型主要包括淚腺摘除[13]、降低周圍環(huán)境濕度[14]、使用阿托品類藥物[15]、局部滴用苯扎氯銨[16]或大氣顆粒物[17]等，然而，人類干眼的病理變化并沒有被精確再現(xiàn)，尤其缺乏符合臨床特征的干眼動物模型。本研究使用10 g·L-1聚維酮碘成功誘導了蒸發(fā)過強型干眼模型，該模型制作簡便、性質(zhì)穩(wěn)定，可作為研究眼表炎癥的理想平臺。

聚維酮碘是臨床上使用最為廣泛的皮膚黏膜消毒劑之一[18]。為了預防眼內(nèi)炎的發(fā)生，晶狀體超聲乳化術(shù)、玻璃體切割術(shù)、青光眼濾過性手術(shù)等內(nèi)眼手術(shù)術(shù)前均常規(guī)使用聚維酮碘消毒[19]，尤其是玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物前使用聚維酮碘進行結(jié)膜囊消毒已被寫入多部指南和專家共識。一項使用濃度為6 g·L-1聚維酮碘局部滴眼治療腺病毒性結(jié)膜炎的臨床研究順利通過Ⅱ期臨床試驗[20]?？梢?，聚維酮碘的廣譜抗菌性和安全性得到了大多數(shù)臨床醫(yī)師的認可。然而，多篇臨床報道指出，聚維酮碘本身具有眼表毒性，局部滴用聚維酮碘有引起結(jié)膜充血、角膜上皮剝脫甚至角膜炎的危險[21-22]。蔣勁等[23]觀察使用不同濃度聚維酮碘兔結(jié)膜囊內(nèi)一次滴眼對角膜的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度(5 g·L-1)聚維酮碘未出現(xiàn)角膜毒性，而聚維酮碘原液(50 g·L-1)可引起嚴重的角膜上皮損傷并產(chǎn)生較重的角膜刺激癥狀。Lee等[24]采用國際通用的檢測某種化學物質(zhì)是否會導致角膜損傷的方法——牛角膜混濁和通透性實驗，通過配置不同濃度的溶液處理牛角膜以評價聚維酮碘的安全性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚維酮碘對角膜組織的損傷隨濃度增加而加劇，濃度為10 g·L-1的聚維酮碘使用后，角膜熒光素染色評分幾乎與陽性對照(純丙酮)相當。反復多次使用聚維酮碘(尤其是多次玻璃體內(nèi)注射時)導致的眼表不良反應(yīng)近年來越來越多地引起臨床工作者的重視，眼表損傷的嚴重程度、藥物劑量與損傷的關(guān)系、脫離接觸后損傷能否完全恢復等一系列問題有待于進一步研究。

有關(guān)聚維酮碘所致眼表改變的病理生理機制目前知之甚少。Shibata等[25]觀察聚維酮碘對培養(yǎng)的角膜上皮細胞的影響，提出聚維酮碘引起角膜上皮細胞損傷的主要原因在于游離碘的直接損傷、溶液中的低pH值以及聚桂醇表面活性劑的細胞毒性。我們在前期研究中[7]使用不同濃度聚維酮碘結(jié)膜囊內(nèi)一次滴眼觀察對大鼠角膜的影響，滴眼后12 h摘出眼球行組織病理學檢查，發(fā)現(xiàn)濃度為10 g·L-1的聚維酮碘處理組的角膜出現(xiàn)少量上皮細胞脫落；濃度為50 g·L-1的聚維酮碘處理組的中央角膜上皮細胞全層缺失，基質(zhì)細胞數(shù)量明顯下降，TUNEL檢測提示角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞凋亡，提示細胞凋亡可能在聚維酮碘所致眼表損傷中發(fā)揮作用。本研究使用10 g·L-1聚維酮碘局部滴眼建立干眼模型，角膜共聚焦顯微鏡檢查及角膜組織切片均發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤，提示炎癥可能在聚維酮碘引起的眼表損傷中發(fā)揮重要作用。炎癥與干眼互為因果，相互促進，炎癥細胞浸潤通常是眼表損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可能導致角膜上皮細胞凋亡以及鱗狀上皮化生[26]，慢性或嚴重炎癥也可能降低杯狀細胞的數(shù)量，這會惡化聚維酮碘誘導的眼表損傷，包括角膜染色評分增加和結(jié)膜PAS染色陽性的杯狀細胞數(shù)量減少。干眼的發(fā)病機制復雜，多種炎癥細胞和炎癥因子在干眼的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同的作用，我們接下來進行的分子生物學研究將為揭示模型的具體病理生理機制提供有力的支持。

我們前期研究(5 g·L-1聚維酮碘結(jié)膜囊滴眼，一天2次，共滴眼14 d)發(fā)現(xiàn)，低濃度的聚維酮碘不會引起明顯的淚膜穩(wěn)定性變化，而臨床常用的聚維酮碘原液(濃度為50 g·L-1)對角膜組織刺激性太大，預實驗結(jié)果顯示每天2次滴眼后SD大鼠角膜很快出現(xiàn)上皮剝脫和水腫，滴眼3 d后即可觀察到角膜新生血管長入。因此，本研究我們選擇10 g·L-1作為聚維酮碘的最佳滴眼液濃度誘發(fā)干眼。在將來的眼表毒性研究中，研究不同濃度聚維酮碘引起的眼表改變將是有趣的課題。除此之外，干眼是一個復雜的過程，淚膜穩(wěn)態(tài)的失衡往往是多重因素共同作用的結(jié)果，在聚維酮碘誘導的干眼模型中，是否有氧化應(yīng)激、細胞自噬、神經(jīng)損傷等機制參與尚不得而知，需要更深入的研究加以探索。

綜上所述，10 g·L-1聚維酮碘局部滴眼可引起實驗大鼠眼表結(jié)構(gòu)損傷和淚膜穩(wěn)定性下降，聚維酮碘的眼表毒性有必要引起臨床醫(yī)師的高度重視。另外，我們通過10 g·L-1聚維酮碘局部滴眼成功誘導了蒸發(fā)過強型干眼模型，為研究干眼的病理生理學特點、發(fā)病機制和治療提供了簡便易行且穩(wěn)定的造模方式，具有較強的理論和現(xiàn)實意義。