陳萌萌，仇汝龍，范志宇，胡波，宋艷華，魏后軍，朱偉峰，徐為中，王芳

摘要：以新發(fā)生的兔出血癥病毒2型（RHDV2）SC 2020/04株VP60基因序列為參考，設(shè)計出1對特異性引物和TaqMan探針，建立了一種快速、靈敏且特異的用于檢測新型病毒的熒光定量RT-PCR檢測方法。試驗結(jié)果顯示：本研究建立的方法，標準曲線線性關(guān)系良好，R2值達到0.999;其特異性較好，與兔出血癥病毒1型（RHDV1）、仙臺病毒（SV）和輪狀病毒（RRV）病原均無交叉反應(yīng);靈敏性高，最低檢出量為1μl 1×10 拷貝;且重復(fù)性良好，批內(nèi)和批間試驗的變異系數(shù)平均值均小于2%。臨床檢測結(jié)果表明，利用該方法對108份臨床病料進行檢測，檢出RHDV2陽性樣品72份，檢出率為66.7%，明顯高于常規(guī)的RT-PCR方法（62.0%）。結(jié)果證明，新建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法適合于RHDV2感染的特異性診斷。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒2型;TaqMan探針;熒光定量RT-PCR;敏感性;特異性

中圖分類號：S855.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1476-05

Establishment and application of a TaqMan-based fluorescence quantitative real-time PCR assay for detection of rabbit hemorrhagic disease virus type 2

CHEN Meng-meng，QIU Ru-long，F(xiàn)AN Zhi-yu，HU Bo，SONG Yan-hua，WEI Hou-jun，ZHU Wei-feng，XU Wei-zhong，WANG Fang

（Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Veterinary Bio-Product Engineering， Ministry of Agriculture， Nanjing 210014， China）

Abstract：A rapid， sensitive and specific fluorescence quantitative real-time PCR （RT-qPCR） method for the detection of rabbit hemorrhagic disease virus type 2 （RHDV2） was established. A pair of specific primers and TaqMan probes were designed in the conserved region of VP60 gene of the new variant strain SC 2020/04. The results showed that the standard curve had a good linear relationship， the R2 was 0.999. The TaqMan-based RT-qPCR method had good specificity and no cross reactions with rabbit hemorrhagic disease virus type1 （RHDV1）， sendai virus （SV） and rotavirus （RRV）. The method established in this study had high sensitivity， and the minimum detectable amount was 10 copies per microlitre. Moreover， the repeatability was good， and the mean coefficient of variation was less than 2%. The TaqMan-based RT-qPCR method was used to detect 108 clinical samples. The detection rate was 66.7%， which was higher than that of conventional RT-PCR. To sum up，the newly established TaqMan-based RT-qPCR method is suitable for the specific diagnosis of RHDV2 infection.

Key words：rabbit hemorrhagic disease virus type 2;TaqMan probe;fluorescence quantitative real-time PCR;sensitivity;specificity

兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染家兔可引起兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）。這是一種致死率高達90%的毀滅性傳染病，該病首次于1984年在中國報道，隨后在全球范圍內(nèi)大肆傳播，給世界養(yǎng)兔業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

RHDV目前分為2種基因型：RHDV1（基因型GI.1）和RHDV2 （基因型GI.2）。自1984年中國首次報道RHD暴發(fā)之后的30多年里，中國主要流行RHDV1的GI.1a 和GI.1c基因型毒株[1-2]。2010年，法國首次發(fā)現(xiàn)RHDV新的基因型RHDV2，該毒株具有獨特的遺傳和抗原特征[2-3]，在歐洲、澳大利亞和非洲等多個國家廣泛傳播[4-7]。目前，在國外RHDV2具有取代RHDV1的趨勢，并且出現(xiàn)了高致病性RHDV2毒株，對中國兔養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展存在潛在的威脅。

我們新近分離報道了一株新的RHDV毒株，該株于2020年4月在中國四川省的養(yǎng)殖場兔子身上采集。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，該新分離株與RHDV2在同一分支， 與荷蘭NL2016株核苷酸序列同源性最高（98.3%;MN061492）， 屬于RHDV2 GI.2基因群。這是在中國首次發(fā)現(xiàn)的RHDV2 毒株[8]，我們將該分離株命名為SC2020/04 （登陸號：MT383749）。在致病性方面，與RHDV1相比，RHDV2更具危害性，不僅能夠感染不同日齡的家兔，還能感染不同種的野兔，感染兔病死率可達80%。在遺傳特性及抗原性方面，RHDV2與RHDV1也存在較大差異。兔病毒性出血癥1型疫苗對RHDV2的交叉保護較差，不能有效抵抗 RHDV2 的感染[9]?？梢灶A(yù)測，RHDV2倘若在中國流行，將會給兔養(yǎng)殖業(yè)帶來災(zāi)難性的危害。

RHDV2與RHDV1感染引起的家兔臨床癥狀極為相似，所以通過臨床癥狀難以進行鑒別診斷，需要分子生物學檢測手段進行診斷。目前通過實驗室檢測發(fā)現(xiàn)已有的用于檢測RHDV1的RT-PCR、膠體金試紙條和ELISA等方法并不適用于RHDV2的特異性檢測。因此急需建立一種快速有效的診斷方法持續(xù)監(jiān)測臨床發(fā)病情況。熒光定量RT-PCR方法通過熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR過程，具有高效、特異和靈敏等特點，在臨床疾病的診斷方面廣泛應(yīng)用。而已報道的基于國外RHDV2流行毒株建立的實時熒光定量RT-PCR方法，能否用于對國內(nèi)流行毒株的檢測還有待于進一步確認[10-12]。本研究選取中國2020年4月分離的四川株SC2020/04 VP60基因序列，通過分析設(shè)計一組引物和探針，旨在建立一種可檢測RHDV2的TaqMan熒光定量 RT-PCR方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒株與樣品兔出血癥病毒2型SC2020/04分離株（RHDV2）、兔出血癥病毒1型GI.1a和GI.1c株（RHDV1）、仙臺病毒（SV）和輪狀病毒（RRV）cDNA由本實驗室保存。臨床待檢樣品為來自全國多地養(yǎng)兔場送檢的病死兔肝臟。

1.1.2主要試劑pMD19-T、2×Taq Master Mix、DNA Marker DL2000、RNAiso Plus（病毒RNA提取試劑）均購自TaKaRa公司。Hiscript III RT SuperMix for qPCR （反轉(zhuǎn)錄試劑）、Ace UniversalU+ probe Master Mix V2（探針法熒光定量試劑盒）均為諾唯贊生物有限公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器設(shè)備普通PCR擴增儀，購自Eppendorf公司。凝膠成相儀，購自Tanon公司。Q-one Real-Time PCR儀，購自Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1引物和探針根據(jù)RHDV2分離株SC2020/04 （GenBank No. MT383749）中保守VP60基因序列， 利用Primer Express 3.0.1軟件設(shè)計熒光定量RT-PCR引物和探針， 上游引物為5′-CGGTTTGCCGCCATTG-3′，下游引物為5′ -CCAAAGCTCAAGCACGTTTG-3′，TaqMan探針序列為5′ -FAM- AACGCAAGTTTCCCTGGAAGCAGTTC-BHQ1-3′，引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用無菌水將引物和探針稀釋至10 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2標準質(zhì)粒制備用RHDV2分離株SC2020/04 VP60基因全長引物克隆目的基因， 將擴增到的VP60基因序列連接到pMD19-T載體上，篩選并測序后獲得陽性pMD19-T-SC2020-VP60重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用Nano drop進行濃度測定并計算拷貝數(shù)，用去離子水將重組質(zhì)粒稀釋成1 μl 1×103拷貝～1×108拷貝， 作為模板標準品。

1.2.3標準曲線的建立20 μl反應(yīng)體系：采用Ace Universal U+ probe Master Mix V2試劑盒，2×Ace Universal U+ probe Master Mix V2 10.0 μl ，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μl，探針 0.2 μl，標準品質(zhì)粒2.0 μl，DEPC水7.0 μl。反應(yīng)條件為：37 ℃ 2 min;95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)，使用Q-One Real-Time PCR System 進行檢測，并生成標準曲線。

1.2.4特異性試驗將1 μl 1×106拷貝的標準品質(zhì)粒作為陽性對照模板，以兔出血癥病毒1型GI.1a株和GI.1c株（RHDV1）、輪狀病毒（RRV）、仙臺病毒（SV）的cDNA為檢測模板，將水作為模板設(shè)立陰性對照，進行特異性試驗。

1.2.5敏感性試驗10倍倍比稀釋質(zhì)粒標準品，選取8個不同的梯度（1 μl 1×101～1×108拷貝），取2 μl作為模板進行敏感性試驗，以水為陰性對照。

1.2.6重復(fù)性試驗選取1 μl 1×104～1×108拷貝稀釋度的質(zhì)粒標準品為模板，進行3批重復(fù)性試驗，批次內(nèi)設(shè)3個重復(fù)。通過計算變異系數(shù)來評價建立方法的穩(wěn)定性。

1.2.7臨床樣品檢測用建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測臨床疑似RHDV2感染的家兔肝臟組織病料108份。

2結(jié)果

2.1質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

利用RHDV2分離株SC2020/04 VP60全長的引物進行PCR擴增，用實驗室儲存的RHDV2- SC2020 cDNA 為模板，將擴增得到的目的片段克隆到pMD19-T載體上，構(gòu)建pMD19-T-SC2020-VP60質(zhì)粒。經(jīng)過測序鑒定，獲得陽性質(zhì)粒。測定DNA濃度，計算拷貝數(shù)，10倍倍比稀釋，梯度為1 μl 1×103～1×108拷貝，將其作為熒光定量RT-PCR的標準品。

2.2標準曲線的繪制

利用優(yōu)化的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系對質(zhì)粒標準品進行擴增，當質(zhì)粒標準品含量在1 μl 1×103～1×108拷貝時，獲得較好的擴增動力學曲線，如圖1所示，標準曲線斜率為-3.072，截距為10.72 ，R2為0.999，擴增效率為111.6%，即標準曲線 Y=-3.072 x+10.72 。

1～6分別為1 μl 1×103～1×108拷貝的標準質(zhì)粒。

2.3TaqMan熒光定量RT-PCR方法的特異性

以1 μl 1×106拷貝標準質(zhì)粒作為模板設(shè)陽性對照，保存的RHDV1（GI.1a株和GI.1c株）、仙臺病毒（SV）和輪狀病毒（RRV）cDNA為模板，檢測所建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法的特異性。如圖2所示，RHDV2 cDNA組出現(xiàn)特異性擴增曲線，而其他病毒cDNA樣品檢測結(jié)果均為陰性，說明本試驗設(shè)計的引物和探針以及建立的檢測方法特異性較好。

2.4TaqMan熒光定量RT-PCR方法的敏感性

對標準品質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，使其含量依次為1 μl 1×101～1×108拷貝。選取該梯度的標準品質(zhì)粒進行敏感性試驗。試驗測得最低檢出量為1 μl 10 拷貝（圖3），對應(yīng)Ct值約為 31.79，敏感度約為常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

2.5TaqMan熒光定量RT-PCR方法的重復(fù)性

選取含量為1 μl 1×104～1×108拷貝的質(zhì)粒標準品進行重復(fù)性試驗，結(jié)果如表1所示，組內(nèi)變異系數(shù)為0.23%～0.65%，組間變異系數(shù)為0.67%～1.57%，說明本試驗建立的方法穩(wěn)定性良好。

2.6臨床病料檢測

利用已建立的TaqMan熒光定量RT-PCR和常規(guī)RT-PCR方法分別對2020年4月至2020年11月份之間所接收的全國不同兔場疑似RHDV2感染的108份臨床樣品進行檢測。結(jié)果表明，常規(guī)RT-PCR方法檢測出RHDV2陽性樣品67份，檢出率為62.0%;TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測出RHDV2陽性樣品72份，檢出率為66.7%，經(jīng)核苷酸序列測定，所有陽性樣品與RHDV2的同源性達99.4%以上，表明TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測臨床樣品更加敏感。

3討論

自2020年4月RHDV2被報道以來，本實驗室陸續(xù)收到全國各地疑似RHDV2感染的臨床樣品108份，RHDV2的陽性檢出率高達66.7%，充分顯示出RHDV2在中國兔場已形成流行態(tài)勢，這將給家兔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來嚴重的威脅。但是，目前中國已建立的用于檢測RHDV1型的診斷方法，如RT-PCR方法[13]和膠體金免疫層析試紙條[14]無法應(yīng)用。因此，急需建立一種快速、高效和敏感的檢測方法來監(jiān)測和防控RHDV2的發(fā)生。

與常規(guī)RT-PCR方法相比，實時熒光定量RT-PCR技術(shù)更加便捷和靈敏，能夠進行高通量和精準的定量[15-16]。在實時熒光定量PCR中常使用的熒光標記染料有SYBR Green I和TaqMan探針兩種，其中TaqMan探針法是根據(jù)病毒序列特異設(shè)計的，所以TaqMan探針能靶向目的基因，在準確性和靈敏度方面明顯優(yōu)于SYBR GreenⅠ法，可以精準檢測病原[17]。目前已建立的針對RHDV2的診斷方法有RT-PCR和基于SYBR Green I的熒光定量RT-PCR。

針對RHDV2 保守的VP60基因，本試驗應(yīng)用軟件Primer Express設(shè)計了引物和探針，通過試驗篩選引物和探針優(yōu)化反應(yīng)條件，成功建立了RHDV2的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。通過繪制標準曲線和線性回歸分析，可見線性關(guān)系良好（R2達到0.999）;利用建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測RHDV2時，與RHDV1、SV和RRV等均無交叉反應(yīng)，說明該方法具有良好的特異性;靈敏度能夠達到1 μl 10 拷貝，比常規(guī)RT-PCR靈敏100倍，說明該方法靈敏度高。通過對108份臨床樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)建立的方法陽性檢出率為66.7 %，高于常規(guī)RT-PCR方法的陽性檢出率，說明該方法具有較高的靈敏性。重復(fù)試驗結(jié)果表明，批間和批內(nèi)試驗變異系數(shù)均小于2%，說明該方法有良好的重復(fù)性。

綜上所述，本研究建立了基于VP60基因的TaqMan熒光定量RT-PCR 檢測RHDV2的方法，此方法具有特異性強和敏感度高等優(yōu)點。在臨床疾病診斷中，可為RHDV2早期流行的監(jiān)測和病原的診斷定量，提供一種快速、簡便、有效的檢測方法。

參考文獻：

[1]HU B， WANG F， FAN Z， et al. Recombination between G2 and G6 strains of rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV） in China[J]. Arch Virol， 2017， 162（1）： 269-272.

[2]HU B， FAN Z， WANG F， et al. A new variant of rabbit hemorrhagic disease virus G2-like strain isolated in China[J]. Virus Res， 2016， 215： 20-24.

[3]LE GALL-RECULE G， LAVAZZA A， MARCHANDEAU S， et al. Emergence of a new lagovirus related to rabbit hemorrhagic disease virus[J]. Vet Res， 2013， 44： 81.

[4]ABRANTES J， LOPES A M， DALTON K P， et al. New variant of rabbit hemorrhagic disease virus， Portugal， 2012-2013[J]. Emerg Infect Dis， 2013， 19（11）： 1900-1902.

[5]LOPES A M， ROUCO C， ESTEVES P J， et al. GI.1b/GI.1b/GI.2 recombinant rabbit hemorrhagic disease virus 2 （Lagovirus europaeus/GI.2） in Morocco， Africa[J]. Arch Virol， 2019， 164（1）： 279-283.

[6]MAHAR J E， HALL R N， PEACOCK D， et al. Rabbit hemorrhagic disease virus 2 （RHDV2; GI.2） is replacing endemic strains of RHDV in the Australian Landscape within 18 months of its arrival[J]. J Virol， 2018， 92（2）： e01374.

[7]PUGGIONI G， CAVADINI P， MAESTRALE C， et al. The new french 2010 rabbit hemorrhagic disease virus causes an RHD-like disease in the Sardinian Cape hare （Lepus capensis mediterraneus）[J]. Vet Res， 2013， 44： 96.

[8]魏后軍，胡波，范志宇，等. 兔出血癥病毒2型的分離鑒定與序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報， 2020， 36（2）： 404-409.

[9]LE GALL-RECULE G， LAVAZZA A， MARCHANDEAU S， et al. Emergence of a new lagovirus related to rabbit haemorrhagic disease virus[J]. Vet Res， 2013， 44： 81.

[10]宋艷華，魏后軍，范志宇，等. 兔出血癥病毒經(jīng)典毒株和變異毒株的RT-PCR鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報， 2016， 32（5）： 1117-1121.

[11]王波. 用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR方法檢測RHDV、RHDV2的初步研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學， 2016.

[12]譚永貴，劉騰，朱杰，等. SYBR Green II熒光定量PCR結(jié)合熔解曲線鑒別不同亞型兔病毒性出血癥病毒方法的建立[J]. 中國動物傳染病學報， 2017， 25（1）： 7-11.

[13]胡波，魏后軍，王芳，等. 兔出血癥病毒RT-PCR檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學報， 2010， 41（11）： 1442-1446.

[14]蔡少平，王芳，賈華敏，等. 兔出血癥病毒膠體金免疫層析試紙條診斷方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學報， 2012， 43（11）： 1795-1801.

[15]吳雙，姜勇，徐建生，等. 鴨坦布蘇病毒、鴨腸炎病毒和番鴨細小病毒TaqMan三重實時熒光定量PCR檢測方法的建立與臨床應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2020，36（3）：626-633.

[16]溫書香，安利民，趙協(xié)，等. 豬偽狂犬病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（7）：50-53.

[17]蒙正群，李桂黎，周麗軍，等. 兔出血癥病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學， 2017， 47（6）： 694-700.

（責任編輯：張震林）

收稿日期：2020-12-28

基金項目：國家自然科學基金項目（31702274）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目（CARS-43-C-1）

作者簡介：陳萌萌 （1987-） ，女，連云港人，博士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。（E-mail）moonchen2010@yeah.net

通訊作者：王芳，（E-mail）rwangfang@126.com