李軍，吳霽蓂，高廣春，朱志明，李白，蔣琦，周鴻宇

關(guān)鍵詞：番紅花;柱頭;突變體;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1630-03

Transcriptome analysis of saffron mutant Cs5 with multiple stigmas

LI Jun1，WU Ji-ming2，GAO Guang-chun2，ZHU Zhi-ming3，LI Bai4，JIANG Qi2，ZHOU Hong-yu2

（1. School of Modern Agriculture， Jiaxing Vocational & Technical College， Jiaxing 314036， China;2.School of Medicine Science， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China;3.Jiaxing Xiuzhou Tianhe Saffron Professional Cooperative， Jiaxing 314000， China;4.Jiaxing Academy of Agricultural Sciences， Jiaxing 314016， China）

Key words： saffron;stigma;mutant;transcriptome

番紅花（Crocus sativus L.）為鳶尾科番紅花屬球莖類藥用植物，以其干燥柱頭入藥，具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒等功效，同時(shí)也應(yīng)用于食品、化妝品行業(yè)染料及香料的制作[1-2]。番紅花在浙江、江蘇、上海、四川等地廣泛栽培，但全國種植面積不到667 hm2，占市場需求量的20%左右，大部分還是依賴進(jìn)口，因此番紅花的需求量非常大。然而，由于番紅花為三倍體雄性不育植物，僅靠球莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖，而且每一朵花只有3個(gè)柱頭，所以產(chǎn)量極低[3-4]。因此，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的番紅花品種將有效緩解國內(nèi)外番紅花市場的供求矛盾，具有重要的基礎(chǔ)理論研究價(jià)值和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。

野生型番紅花的花為頂生;花被片6個(gè)，淡紫色，長4～6 cm;雄蕊3個(gè)，雌蕊三心皮合生，子房下位，花柱細(xì)長，黃色柱頭3個(gè)，伸出花被筒外后下垂，深紅色，頂端略膨大。本研究在番紅花生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)了多柱頭突變體Cs5，其雌蕊上端花柱和柱頭數(shù)量均為5個(gè)，形態(tài)與野生型無異，花柱聚合后比野生型粗壯（圖1）。柱頭數(shù)量的增多有助于提高番紅花花絲的產(chǎn)量及花農(nóng)收入，是番紅花新品種培育的主要方向。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)，結(jié)合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析番紅花柱頭發(fā)育的調(diào)控基因AGL6，發(fā)現(xiàn)其可能通過影響花器官的發(fā)育進(jìn)而影響柱頭的生物量，最終影響次生代謝物的產(chǎn)量[2，5-6]。番紅花柱頭數(shù)量是影響產(chǎn)量的一個(gè)重要指標(biāo)，調(diào)控其生長發(fā)育的結(jié)構(gòu)基因的挖掘和調(diào)控機(jī)制的研究有助于解決番紅花資源短缺問題，然而目前相關(guān)研究報(bào)道較少。

目前，RNA-Seq分析測試技術(shù)在植物特異突變、特定發(fā)育時(shí)期以及不同組織器官基因差異表達(dá)等方面的研究中廣泛應(yīng)用[7-9]。本研究擬對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭及其野生型柱頭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)比較分析，篩選差異表達(dá)基因，分析基因功能以及相關(guān)的代謝通路，以期為研究影響番紅花柱頭數(shù)量的相關(guān)調(diào)控基因及相關(guān)信號通路提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

番紅花多柱頭突變體Cs5樣本為浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院番紅花種植基地里的自然突變體，其雄蕊、花柱和柱頭的數(shù)量均為5個(gè)，均比野生型多2個(gè)。于盛花期分別采集番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的柱頭，每10個(gè)1組，設(shè)3次重復(fù)，于-80 ℃超低溫冰箱中凍存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

取各處理組的樣品各0.1 g，液氮研磨，采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒（Invitrogen公司產(chǎn)品）提取柱頭的總RNA，在Illumina HiSeq2500儀器（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品）上進(jìn)行RNA-Seq測序。

1.2差異表達(dá)基因分析和功能注釋

采用Trinity軟件將各處理組的有效數(shù)據(jù)組裝成對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本序列，用Blast軟件將各樣品測序得到的所測讀段與Unigene庫進(jìn)行比對，利用DESeq軟件以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.05且log2 Fold Change≥1為條件篩選差異表達(dá)基因（DEGs）。使用Blast軟件將DEGs與NR、SWISS、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行比對，獲得相應(yīng)的注釋信息。

1.3差異表達(dá)基因的驗(yàn)證及表達(dá)模式分析

分別選取10個(gè)差異表達(dá)基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)的可靠性，以及差異表達(dá)基因在花瓣、葉片、球莖、雄蕊、柱頭等不同組織中的表達(dá)模式。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：總反應(yīng)體積20 μl，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為40個(gè)，72 ℃延伸30 s。用2-△△Ct計(jì)算基因表達(dá)差異。

差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證和表達(dá)模式分析的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用One-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1基因組裝分析

利用Illumina HiSeq2500儀器進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測序，番紅花多柱頭突變體Cs5產(chǎn)生了60 063 054條序列數(shù)，野生型產(chǎn)生了54 706 306條序列數(shù)，各處理組的G、C基本隨機(jī)分布，無明顯偏差。質(zhì)量控制分析后，突變體保留54 984 766條序列，野生型保留49 715 722條序列。采用Trinity軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，對得到的52 317條Unigenes分別進(jìn)行功能注釋，其中NR數(shù)據(jù)庫29 392條，GO數(shù)據(jù)庫20 510條，COG數(shù)據(jù)庫21 126條，KEGG數(shù)據(jù)庫12 875條，SWISS數(shù)據(jù)庫20 510條，其中NR數(shù)據(jù)庫注釋比最高，達(dá)56.18%。

2.2差異表達(dá)基因分析

對番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，共篩選出917個(gè)差異表達(dá)基因，其中番紅花多柱頭突變體Cs5中有412個(gè)（約占44.93%）基因表達(dá)上調(diào)，505個(gè)（約占55.07%）基因表達(dá)下調(diào)。顯著差異表達(dá)基因中包括MADS家族轉(zhuǎn)錄因子基因15個(gè)（包含9個(gè)已鑒定的番紅花MADS類轉(zhuǎn)錄因子基因），MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因19個(gè)，BHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因7個(gè)，WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因5個(gè)，SEUSS家族轉(zhuǎn)錄因子基因6個(gè)，TF1轉(zhuǎn)錄因子基因1個(gè)，與植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因23個(gè)，這些轉(zhuǎn)錄因子基因大多與植物花發(fā)育相關(guān)。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

為了進(jìn)一步驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性，從917個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)基因（包含3個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，7個(gè)下調(diào)表達(dá)基因）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較后發(fā)現(xiàn)，這10個(gè)基因的表達(dá)情況與測序結(jié)果一致，說明本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果真實(shí)可信。

2.4DEGs的GO功能注釋分析

對番紅花多柱頭突變體DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析，有316個(gè)基因被注釋到41個(gè)分類條目上，包括145個(gè)上調(diào)基因和171個(gè)下調(diào)基因。這些基因功能分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類，分別包含141、103、72個(gè)條目。對這3類條目的二級分類結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)DEGs在生物過程條目中主要分布在細(xì)胞過程和代謝過程，在細(xì)胞組分條目中主要包括共質(zhì)體和細(xì)胞膜等，在分子功能條目中主要包括結(jié)合活性和催化活性。

2.5DEGs的KEGG功能注釋分析

通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，對所有DEGs進(jìn)行功能注釋和富集分析。結(jié)果顯示，917個(gè)差異表達(dá)基因被富集在179個(gè)代謝通路中，以校正P值<0.05為條件篩選出20個(gè)顯著富集的代謝通路，包括次生代謝產(chǎn)物生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、淀粉和蔗糖代謝等。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中富集了5個(gè)差異表達(dá)基因，涉及生長素、赤霉素、脫落酸的代謝通路，植物激素在植物生長發(fā)育的不同時(shí)期和不同組織器官中均發(fā)揮重要的作用，番紅花多柱頭突變體Cs5的性狀很有可能與激素表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。

2.6DEGs表達(dá)模式分析

從917個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取10個(gè)差異表達(dá)基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析其在番紅花不同組織器官里的表達(dá)情況。本研究結(jié)果表明，DN34196、DN30594、DN41391、DN24459和DN39219共5個(gè)差異表達(dá)基因在番紅花柱頭中的表達(dá)量與其在雄蕊、花瓣、葉片和球莖中的表達(dá)量有極顯著差異（P<0.01）;DN26020在番紅花柱頭中的表達(dá)量與其在雄蕊和花瓣中的表達(dá)量無顯著差異，與其在葉片和球莖中的表達(dá)量存在極顯著差異（P<0.01）;DN17686和DN31280在柱頭中的表達(dá)量與其在葉片中的表達(dá)量無顯著差異，與其在雄蕊、花瓣和球莖中的表達(dá)量存在極顯著差異（P<0.01）。

3討論

番紅花作為經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的藥用植物，藥用部位的產(chǎn)量一直是科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)[10-11]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭和野生型番紅花柱頭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從中發(fā)現(xiàn)可能與柱頭發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括MADS家族、MYB家族、BHLH家族、WRKY家族、SEUSS家族以及與植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。另外，番紅花突變體中MADS-box基因包含A Class （AP1）、B Class （PI/AP3）、C Class（AG）、D Class（AGL）和E Class（SEP），說明番紅花花發(fā)育過程也涉及到5類基因在不同時(shí)間和空間的精確表達(dá)[6]。

植物自身激素水平在雌蕊發(fā)育過程中扮演著重要角色，本研究發(fā)現(xiàn)一批與生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和脫落酸的合成、失活及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控可以維持植物包括雌蕊在內(nèi)的花器官的正常發(fā)育[12-13]。番紅花柱頭的發(fā)育質(zhì)量和數(shù)量直接影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，多柱頭突變體的發(fā)現(xiàn)一方面可以為通過組培快繁技術(shù)快速擴(kuò)繁突變體數(shù)量，提高番紅花產(chǎn)量的研究提供試驗(yàn)材料，另一方面本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)使得解析多柱頭突變體形成機(jī)制，以及通過生物技術(shù)調(diào)控、創(chuàng)制更多突變體成為了可能。隨著基因組﹑轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，相信將來在番紅花柱頭生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上的一些蛋白質(zhì)生物學(xué)功能和基因間互作關(guān)系的研究會(huì)有更大突破。

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（責(zé)任編輯：王妮）

收稿日期：2021-04-12

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81703667）;嘉興市公益性研究計(jì)劃項(xiàng)目（2020AY10023）;浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2020R417016）;嘉興市科技特派員專項(xiàng)項(xiàng)目（2021K117）;嘉興學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力個(gè)性化培養(yǎng)項(xiàng)目

作者簡介：李軍（1981-），男，山東泰安人，博士，副研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究。（E-mail）lijunjx1@163.com

通訊作者：高廣春，（E-mail）gaogcjx@163.com