董靖，張露珊，劉紹春，張國棟，周順，楊秋紅，艾曉輝

1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所/湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，武漢 430223；2.岳陽漁美康生物科技有限公司，岳陽 414100

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，原產(chǎn)于墨西哥東北部和中美洲南部地區(qū)，1929年經(jīng)日本引進(jìn)到中國，因其可以為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、維生素B和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分而成為風(fēng)靡多個國家和地區(qū)的食品[1-2]。近年來隨著國內(nèi)小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，養(yǎng)殖的集約化程度也有所提升，但由于基礎(chǔ)薄弱、優(yōu)質(zhì)種苗供應(yīng)不足、病害多發(fā)和藥物濫用等問題嚴(yán)重阻礙小龍蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。尤其小龍蝦養(yǎng)殖進(jìn)入5月份后往往會大面積暴發(fā)疾病，造成小龍蝦大量死亡，通常稱為“五月瘟”[3]。其中，由強(qiáng)致病性的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等病原體導(dǎo)致的小龍蝦各種感染性疾病尤為嚴(yán)重[4]?；瘜W(xué)類抗菌藥物是日常生產(chǎn)中用于防治小龍蝦病害的主要手段，但極易導(dǎo)致環(huán)境中抗菌藥物的污染和細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。此外，大量化學(xué)抗菌藥物的使用容易造成藥物在小龍蝦體內(nèi)的蓄積和殘留，影響小龍蝦產(chǎn)品的質(zhì)量安全[5-6]。

肺炎克雷伯菌隸屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，是一種常見的條件性致病菌，也是一種重要的人獸魚共患病原菌，能導(dǎo)致魚類、陸生動物和人的多種感染性疾病[7]。自1992年首次在海、淡水魚水產(chǎn)品中檢測到肺炎克雷伯菌后，肺炎克雷伯菌被發(fā)現(xiàn)能導(dǎo)致多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的感染，如大鯢(Andriasdavidianus)、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、中華鱉(Trionyxsinensis)等[8-10]。疫苗和化學(xué)抗菌藥物是治療肺炎克雷伯菌感染的主要手段，但目前尚無用于水產(chǎn)養(yǎng)殖源肺炎克雷伯菌感染的疫苗面世。因此，對水產(chǎn)養(yǎng)殖源肺炎克雷伯菌感染的治療主要依賴化學(xué)抗菌藥物[7,11]。而抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和濫用也不可避免地導(dǎo)致了肺炎克雷伯菌耐藥菌株的產(chǎn)生。

2019年5月湖北省潛江市一小龍蝦養(yǎng)殖場發(fā)生了小龍蝦“五月瘟”，導(dǎo)致了大量的小龍蝦死亡。筆者通過對患病小龍蝦的病原學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其存在肺炎克雷伯菌感染的情況，進(jìn)一步通過回歸感染試驗確定了該分離菌株對小龍蝦的致病力。此外，通過藥敏試驗和最小抑菌濃度測定等方法研究了該分離菌株的敏感性，旨在為小龍蝦“五月瘟”病原分析和疾病防控提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病小龍蝦樣品采集自湖北省潛江市某小龍蝦養(yǎng)殖場；用于回歸感染試驗的健康小龍蝦來自長江水產(chǎn)研究所荊州基地；抗生素標(biāo)準(zhǔn)品頭孢拉定、氨曲南、氨芐西林、亞胺培南、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、多粘菌素E、美羅培南、環(huán)丙沙星、阿莫西林、頭孢他啶、氟苯尼考、四環(huán)素、苯唑西林、恩諾沙星、多西環(huán)素購自北京索萊寶科技有限公司；頭孢唑肟、慶大霉素、阿奇霉素購自上海源葉生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR Master Mix等分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa公司；腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基購自青島海博生物有限公司。

1.2 細(xì)菌分離和純化

取瀕死小龍蝦在無菌條件下用生理鹽水反復(fù)沖洗體表3～5次，在超凈工作臺中剖取小龍蝦的肝胰腺，用生理鹽水沖洗后采用勻漿器將其研磨均勻。取研磨液在腦心浸液(BHI)固體培養(yǎng)基上劃線，將平板置于30 ℃培養(yǎng)16～20 h。從平板中挑取單菌落反復(fù)劃線純化2～3次，將得到的純化菌株置于4 ℃保存，標(biāo)記為L20190516。

1.3 回歸感染試驗

從純化好的平板無菌挑取L20190516菌株的單菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。培養(yǎng)好的菌液用麥?zhǔn)媳葷峁芟♂尦?.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104cfu/mL的菌懸液。選取活力較好、無明顯外傷的小龍蝦作為試驗動物，每組30尾，通過腹腔注射的方式在第2腹節(jié)和第3腹節(jié)之間注射菌液0.1 mL，陰性對照組注射0.1 mL無菌生理鹽水。將注射后的蝦暫養(yǎng)于玻璃缸內(nèi)，保持水溫23～25 ℃，溶氧在5.5～7.5 mg/L，期間正常換水但不投喂飼料。感染后每天觀察并記錄不同組別小龍蝦的活動情況和死亡數(shù)，連續(xù)觀察10 d。通過Bliss法計算其半數(shù)致死濃度 (LC50)[12]。取感染后瀕死的小龍蝦肝胰腺進(jìn)行病原的分離和鑒定。

1.4 細(xì)菌生理生化鑒定

從純化的平板上挑取L20190516菌株的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。此外，將受試菌株的單菌落用無菌生理鹽水重懸后加入到API20E生化鑒定試劑條上，按產(chǎn)品說明書操作，在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后將鑒定試劑條置于ATB 32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行生化鑒定。

1.5 細(xì)菌分子鑒定

參照細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說明書提取菌株L20190516的全基因，以提取的全基因組作為模板，采用16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增[13]。用于鑒定的通用引物核苷酸序列：上游引物(16S rRNA-F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′，下游引物(16S rRNA-R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′， PCR產(chǎn)物的長度約為1 500 bp。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠檢測并測序。采用Blast軟件對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比對。從Blast結(jié)果中選取與菌株L20190516同源性較高的相關(guān)已知序列，采用MEGA5.1軟件進(jìn)行多重序列比對分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，校正模型為Kimura 2-parameter，通過Bootstraps法自舉數(shù)集1 000次。

1.6 藥物敏感性測試

L20190516菌株對常用抗菌藥物的敏感性通過紙片擴(kuò)散法(K-B)進(jìn)行測定[14-15]。在超凈工作臺中無菌挑取L20190516單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。培養(yǎng)好的菌液通過離心收集菌體并用無菌PBS重懸，通過麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕簼舛日{(diào)整至1.5×108cfu/mL。將菌液充分混勻后涂布至MH瓊脂培養(yǎng)基上，在30 ℃生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h后用游標(biāo)卡尺測定不同抗菌藥物的抑菌圈直徑。敏感性結(jié)果判定參照杭州微生物試劑有限公司提供的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 最小抑菌濃度測定

采用CLSI推薦的肉湯微量稀釋法測定不同抗菌藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations,MICs)。在96孔板中將配好的抗菌藥物進(jìn)行倍比稀釋，每孔內(nèi)藥物體積為100 μL，然后加入100 μL稀釋好的菌懸液，使每孔中菌懸液的濃度為5×105cfu/mL。每種藥物設(shè)置3次重復(fù)，不加藥不加菌的孔設(shè)置為陰性對照，不加藥加菌的孔設(shè)置為陽性對照。將加好的培養(yǎng)板放置于生化培養(yǎng)箱中，30 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h。MICs定義為沒有細(xì)菌生長的最小濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的培養(yǎng)特性

發(fā)病小龍蝦活力降低，應(yīng)激能力差，采食量下降，進(jìn)地籠后死亡的現(xiàn)象較多，其中大蝦死亡情況較為嚴(yán)重。剖檢發(fā)現(xiàn)其肝胰腺發(fā)白，腸道內(nèi)容物較少，肝胰腺積水。采取患病蝦的肝胰腺進(jìn)行細(xì)菌分離，得到的優(yōu)勢菌在平板上形成半透明、顏色灰白、中央隆起的光滑菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為短桿狀革蘭氏陰性菌。

2.2 分離株對小龍蝦的毒力

健康小龍蝦注射不同劑量的L20190516菌懸液后出現(xiàn)了一定程度的發(fā)病和死亡，高濃度攻毒組出現(xiàn)了急性死亡現(xiàn)象，在3 d內(nèi)全部死亡，而陰性對照組在試驗期間沒有明顯的發(fā)病和死亡(表1)。感染后的小龍蝦表現(xiàn)為活動減緩、無力等癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)其肝胰腺發(fā)白，有部分出現(xiàn)積水現(xiàn)象。采用Bliss法得到了該菌株對小龍蝦的LC50為2.13×105cfu/mL。對出現(xiàn)典型癥狀及瀕死小龍蝦進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離得到了與L20190516菌株性狀一致的菌落。

表1 分離株感染健康小龍蝦后的死亡率 Table 1 Mortality of the isolate on healthy crayfish

2.3 生化鑒定結(jié)果

對分離純化的優(yōu)勢菌接種于API20E生化鑒定條，經(jīng)過孵育后置于ATB細(xì)菌自動鑒定系統(tǒng)中鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該優(yōu)勢菌的生化特征符合肺炎克雷伯菌的特征，相似度大于98%。生化鑒定結(jié)果見表2。

表2 分離株的生化鑒定結(jié)果 Table 2 Biochemical characterization of the isolate

2.4 16S rRNA序列分析

通過PCR擴(kuò)增得到了分離株L20190516的16S rRNA片段，長度約為1 500 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序。將得到的序列(MT409892)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知基因序列同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株L20190516與肺炎克雷伯菌(KX237750.1、KU937377.1)、大腸桿菌(LR025099.1)、產(chǎn)氣克雷伯菌(LR134254.1)聚為一支(圖1)，同源性為99%。結(jié)合該菌株的生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育樹情況將該菌株判定為肺炎克雷伯菌。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

通過K-B法測定20種化學(xué)抗菌藥物的敏感性，其結(jié)果見表3。該菌株對頭孢噻肟、多粘菌素B敏感，對新霉素、亞胺培南中度敏感，對恩諾沙星、多西環(huán)素、氟苯尼考等16種藥物耐藥。通過肉湯微量稀釋法測定20種藥物的最小抑菌濃度，結(jié)果如表4所示。

圖1 L20190516菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 L20190516分離株對20種抗菌藥物敏感性 Table 3 Antibiotic susceptibility of L20190516strain to 20 kinds of antibiotics

表4 抗菌藥物對L20190516分離株的MICs Table 4 The MICs of antibiotics to L20190516

3 討 論

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，有關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖來源的致病菌的報道越來越多，病害頻發(fā)對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了一定的影響。隨著小龍蝦消費(fèi)市場的打開，人們養(yǎng)殖小龍蝦的熱情高漲，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和面積的不斷增加，小龍蝦病害也越來越多，給小龍蝦養(yǎng)殖造成了慘重的損失[16]。小龍蝦的細(xì)菌性病害主要由檸檬酸桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬等引起[16-19]。本試驗首次從湖北潛江發(fā)病小龍蝦中分離到1株優(yōu)勢菌，經(jīng)過回歸感染試驗發(fā)現(xiàn)該菌株對健康小龍蝦致病，在感染小龍蝦體內(nèi)再次分離到該菌株，而陰性對照組未分離到；進(jìn)一步通過生理生化鑒定、16S rRNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將該菌株鑒定為肺炎克雷伯菌。此外，本試驗通過ELISA法(酶免生物)和鏡檢法分別排除了患病小龍蝦感染白斑綜合征病毒和寄生蟲的可能?；貧w感染試驗前將小龍蝦暫養(yǎng)10 d后再選取健康個體入組，試驗時設(shè)置了注射無菌生理鹽水的陰性對照組且在試驗過程中陰性對照組未發(fā)生死亡，表明各試驗組小龍蝦的死亡均由感染肺炎克雷伯菌引起，而非未檢測到的未知病原體。

譚愛萍等[11]、盧玉婷等[20]、滕濤等[9]分別從鰻鱺、鯉、團(tuán)頭魴體內(nèi)分離到肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)該菌主要引起養(yǎng)殖魚類的腹水、內(nèi)臟器官充血腫脹等癥狀，認(rèn)為肝臟(肝胰腺)可能是肺炎克雷伯菌主要侵害的靶器官。本試驗發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌能導(dǎo)致小龍蝦肝胰腺發(fā)白、采食量下降和腸道內(nèi)容物減少等主要癥狀，該菌感染主要發(fā)生于5月中旬水溫在25 ℃左右時。綜合以上信息可以推斷肺炎克雷伯菌是小龍蝦“五月瘟”的病原體之一。

自2001年首次發(fā)現(xiàn)了對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌后，產(chǎn)KPC酶及耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌不斷被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致臨床中對肺炎克雷伯菌的治療越來越難[21]。滕濤等[9]研究了團(tuán)頭魴源肺炎克雷伯菌對27種抗菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)僅對磷霉素、復(fù)方新諾明和氨曲南3種藥物敏感。譚愛萍等[11]發(fā)現(xiàn)鰻源肺炎克雷伯菌僅對亞胺培南、鏈霉素和阿米卡星3種藥物敏感，對其余17種受試藥物均耐藥。童桂香等[22]分析了山瑞鱉(Paleasteindachneri)肺炎克雷伯菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)該菌對受試的30種藥物中的頭孢西叮、舒普深(頭孢哌酮、舒巴坦)和阿米卡星敏感，對特治星(哌拉西林、他唑巴坦)中度敏感，對其余26種藥物耐藥。從以上研究可以推斷出水產(chǎn)源肺炎克雷伯菌耐藥性較為嚴(yán)重，且大部分分離菌株具有多重耐藥性。本試驗所分離的肺炎克雷伯菌僅對受試的20種抗菌藥物中的頭孢噻肟和多粘菌素B敏感，該結(jié)果提示本次分離的菌株為多重耐藥肺炎克雷伯菌。