李司棋，楊秋紅，何緒剛，劉永濤，董靖，楊移斌，胥寧，艾曉輝，劉紹春

1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢 430070；2.中國水產科學研究院長江水產研究所/湖北省水產品質量安全工程技術研究中心/農業(yè)農村部水產品質量安全控制重點實驗室， 武漢430223；3.中國水產科學研究院質量與標準研究中心/農業(yè)農村部水產品質量安全控制重點實驗室，北京100141；4.岳陽漁美康生物科技有限公司，岳陽 414000

吡蟲啉是國內近年發(fā)展最快的新煙堿類(neonicotinoid)殺蟲劑，可防治多種抗性害蟲，作用效果持久高效，殺蟲譜廣，毒性低，殘留少，尤其對刺吸式口器害蟲具有特殊作用，并具有很大的發(fā)展?jié)摿1]。新煙堿類殺蟲劑是除擬除蟲菊酯以外市場占有率增長最快的殺蟲劑[2]。研究表明，只有約1%的農藥作用于目標生物。其余的一部分殘留在土壤中，和土壤形成結合殘留態(tài)，結合殘留量一般占使用量的20%～70%[3]，還有一部分間接進入水環(huán)境，進而影響土壤生物和水生生物[4]。

農藥給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來危害的事件屢見不鮮。1962年在日本北海道，由于在稻田中使用五氯酚鈉，一次有超過9萬t的魚被毒死[5]。在中國，也發(fā)生過由于飛機噴藥不當，大量魚蝦類死亡的事故。此外，相關研究也證實了吡蟲啉對水產動物生理生化和抗氧化系統(tǒng)具有潛在的危害，如熱帶魚類條紋鯪脂鯉(Prochiloduslineatus)在吡蟲啉質量濃度為1 250 μg/L暴露120 h抗氧化酶會產生反應，出現(xiàn)血糖降低和DNA損傷[6]；稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)暴露在2.0 mg/L吡蟲啉中也出現(xiàn)了氧化應激和遺傳損傷，紅細胞發(fā)生明顯變化，免疫應答降低[7]。吡蟲啉對沼蝦48 h LC50<1.0 mg/L，參照農藥對魚類的毒性等級劃分標準，吡蟲啉對蝦類屬于高毒農藥[8]。隨著克氏原鰲蝦產業(yè)的火熱升溫和稻漁綜合種養(yǎng)模式的推廣[9]，農藥在稻漁綜合種養(yǎng)模式下使用頻率的增加，水-底泥-克氏原螯蝦中的殘留問題也越來越多地引起關注[10]。筆者通過室內暴露試驗以及室外田間殘留消除試驗，研究吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的富集和殘留消除情況，以期評價吡蟲啉對克氏原鰲蝦的安全性，為制定合理的農藥控制技術提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試 劑

60%吡蟲啉懸浮劑(有效成分為300 g/L，中國農科院植保所廊坊農藥中試廠)；吡蟲啉標準品(純度99.8%)(德國 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司)；乙酸、乙腈、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯(色譜純；美國CNW公司)；C18粉、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑粉(GCB) (博納艾杰爾科技公司)；超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm，美國Millipore公司)。

1.2 試驗動物

試驗所用的克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)購于湖北省荊州市沙市農場洪塘分場，體質量(17.31±0.89) g，在試驗前，將其置于玻璃水族箱中馴養(yǎng)一段時間，試驗用水為充分曝氣的自來水，并持續(xù)供氧，水溫(19.7±0.24) ℃，溶氧為(7.22±0.11) mg/L，每天換水并投喂飼料。選擇健康完整的克氏原螯蝦進行試驗，試驗前1 d停止喂食，試驗過程中不再喂食。

1.3 試驗設計與采樣

1)室內暴露試驗。選取吡蟲啉質量濃度0.2 mg/L(參考鄭嵐等[11]施藥的推薦劑量)為試驗組，同時設置空白組。試驗過程采用靜水藥浴的方法，吡蟲啉質量濃度由60%吡蟲啉懸浮劑(有效成分為300 g/L)稀釋配制而成。空白組分別采集肌肉、血淋巴、鰓組織、腸道、肝胰臟等組織測定吡蟲啉的含量，檢測值均為空白，之后開始暴露試驗。暴露試驗在50 cm×35 cm×30 cm水族箱中進行，每箱放10只克氏原鰲蝦，設置水溫在(20±1) ℃，測得水體pH 6.68±0.18，溶氧為(7.32±0.21) mg/L。

暴露后的第2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144小時分別從試驗組隨機取18只克氏原鰲蝦，6只為1個平行，先用純凈水沖洗蝦體表面殘余藥物，再用干凈的紗布吸取蝦體表面水分，采集肌肉、血淋巴、鰓組織、腸道、肝胰臟等組織測定吡蟲啉的含量。肌肉、肝胰臟、血淋巴取樣方法參考岳剛毅[12]的方法，腸道從尾部抽出[13]，取出適量鰓組織，剔除附著物，用濾紙吸干表面水分。樣品在正式處理之前都置于-20 ℃冰箱保存。同時在0、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144 h從試驗組采集水樣500 mL進行前處理。

2)田間殘留消除試驗。 試驗地點在湖北省應城市稻蝦養(yǎng)殖示范基地，圍取長寬高5 m×4 m×0.2 m種植水草的水田，四周壘梗作為試驗區(qū)域。60%吡蟲啉懸浮劑以0.2 mg/L(參考鄭嵐等[11]施藥的推薦劑量)用量均勻噴霧，分別于施藥后0.083、0.5、1、2、3、4、5、6、7、14、21、28 d采集樣品，克氏原鰲蝦樣品采集方法和采集組織同本文材料與方法“1.3”中“1)”。同時采集水樣，每個時間點取3個平行，每個水樣不少于500 mL，裝入棕色樣品瓶中，-4 ℃保存。底泥按照上述時間點采集，每個時間點取3個平行，每個樣品不少于200 g，貯于-20 ℃低溫冰柜內保存。試驗期間水溫在8～26 ℃，水體pH 7.28±0.20，溶氧為(7.13±0.18) mg/L。

1.4 液相色譜-質譜條件

液相色譜柱：Symmetry C18柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μm，美國Waters公司)；柱溫：40 ℃；流速為300 μL/min；流動相A：80%甲醇，B：20%水，進樣量為10 μL。

質譜離子源：加熱大氣壓電噴霧HESI；離子化模式：正離子模式；掃描方式：選擇離子反應監(jiān)測模式(SRM)；噴霧電壓：3 500 V；蒸發(fā)氣溫度：200 ℃；鞘氣和輔助氣均為高純氮氣，壓力均為500 kPa；碰撞氣為高純氬氣，200 Pa；離子傳輸毛細管溫度：350 ℃；一級質譜掃描(Q1 )半峰寬： 0.7 ku，三級質譜掃描(Q3 )半峰寬： 0.7 ku。

1.5 樣品提取和凈化

克氏原鰲蝦組織、水樣、底泥樣品的前處理方法參考筆者所在研究室已發(fā)表文獻[10]。

1.6 標準溶液的配制

準確稱取適量吡蟲啉標準品，用甲醇溶解制得質量濃度為100 mg/L的標準儲備液，避光貯存在4 ℃冰箱；根據(jù)需要用流動相稀釋標準儲備液，配制質量濃度為0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 μg/L的一系列標準工作液。

取空白克氏原螯蝦樣品按照本文“1.5”進行處理，定容得到空白樣品溶液，然后用空白樣品溶液稀釋吡蟲啉標準儲備液，配制吡蟲啉質量濃度為0.2～50.0 μg/L一系列范圍的空白基質匹配標準溶液。

2 結果與分析

2.1 線性范圍和檢出限

以色譜峰面積為縱坐標，對應的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。測定結果表明，吡蟲啉在質量濃度為0.2～50.0 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(shù)≥0.990 4。以信噪比S/N=3確定方法的檢出限、信噪比S/N=10確定方法的定量限具體結果見表1。

表1 吡蟲啉的檢出限、定量限、線性范圍和線性方程 Table 1 Linear range,regression equation,limit of detection(LOD) and limit of quantification(LOQ) of imidacloprid

2.2 基質效應

通過比較基質匹配標準曲線與溶劑標準曲線斜率值來評價基質效應，比值越接近1，基質效應越小，比值越遠離1，基質效應越大。基質效應小，溶劑標準曲線可直接用于定量分析；基質效應較大，為了消除基質效應，采用基質標準曲線進行定量。試驗結果表明，吡蟲啉在克氏原螯蝦肌肉、血淋巴、鰓組織、腸道、肝胰臟的基質比率分別為0.42、1.07、1.01、1.03、0.67，其中肌肉和肝胰臟基質效應較大。

2.3 回收率的測定

取已制備好的克氏原螯蝦、水樣和底泥的空白樣品，分別在樣品中添加低、中、高濃度的吡蟲啉標準品各5份，按本文“1.5”方法進行樣品提取和凈化，測定樣品回收率。結果表明，吡蟲啉在克氏原鰲蝦樣品中的平均添加回收率為62.64%～104.79%，變異系數(shù)為1.15%～11.93%，吡蟲啉在水樣中的平均添加回收率為88.29%～110.42%，變異系數(shù)為2.16%～3.25%，吡蟲啉在底泥中的平均添加回收率為89.38%～116.60%，變異系數(shù)為2.05%～7.51%，表明該方法的準確度和精確度能滿足農藥殘留測定的要求。

2.4 吡蟲啉在室內試驗下的富集情況

1) 吡蟲啉在克氏原鰲蝦體內的富集情況。由表2可知，吡蟲啉在推薦使用的質量濃度下，肌肉的富集曲線呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在推薦使用質量濃度下暴露的前6 h中，吡蟲啉的累積含量上升速率較平緩，然后呈現(xiàn)上升趨勢，并在24 h達到最大累積量101.09 μg/kg。肝胰臟的富集曲線與肌肉相似，推薦使用濃度下暴露12 h之前，吡蟲啉在肝胰臟的富集量都呈現(xiàn)平穩(wěn)上升狀態(tài)，72 h達到最大累積量36.00 μg/kg，然后下降?？耸显椢r的鰓組織對吡蟲啉的富集與其他組織相比要迅速很多，最大累積時間較其他器官提前許多，并且累積量也高出許多。這是因為鰓是克氏原鰲蝦的重要呼吸器官，是與外界進行氣體交換的重要器官。鰓組織在第2小時吡蟲啉的含量為37.20 μg/kg，后面呈現(xiàn)階梯式上升，并在48 h達到最大值110.97 μg/kg，隨后又下降穩(wěn)定在一定濃度水平。腸道和血淋巴的富集曲線較簡單，暴露農藥的前24 h，都呈現(xiàn)上升的趨勢，腸道和血淋巴在24 h吡蟲啉的累積量達到最大，分別是80.72 、81.43 μg/kg。但不同的是，24 h之后，吡蟲啉在腸道中吡蟲啉的含量出現(xiàn)下降趨勢，而考慮到血淋巴和腸道分別作為克氏原鰲蝦的循環(huán)和消化器官，腸道能將部分毒物排出，而血淋巴可將部分毒物隨血液流動緩慢釋放到機體其他組織。吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的累積量表現(xiàn)為鰓組織>肌肉>血淋巴>腸道>肝胰臟。

表2 吡蟲啉在克氏原鰲蝦體內各組織的富集情況 Table 2 Enrichment of imidacloprid in various tissues of Procambarus clarkii

2) 吡蟲啉在水體中的富集消除情況。在推薦使用濃度下，水體中吡蟲啉的含量隨著時間的推移，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，暴露144 h，水體中吡蟲啉的含量下降到103.42 μg/L。

表3 吡蟲啉在水體中的富集消除情況 Table 3 Enrichment and elimination of imidacloprid in water

2.5 吡蟲啉在稻蝦綜合種養(yǎng)模式下的殘留消除情況

1) 吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的殘留消除情況。如表4所示，按推薦使用濃度施藥吡蟲啉之后，吡蟲啉在肌肉中的消解動態(tài)呈現(xiàn)波動式的下降趨勢，施藥后的2、14 d，吡蟲啉在肌肉中達到了較高的累積量(84.93、74.81 μg/kg)。14 d之后隨著時間的增加呈現(xiàn)逐步下降的趨勢，28 d降至20.44 μg/kg。吡蟲啉在鰓組織的消解動態(tài)，整體呈現(xiàn)下降趨勢，28 d降至1.28 μg/kg。吡蟲啉在血淋巴和腸道中的消解動態(tài)相似，施藥后都呈現(xiàn)波動式的上升趨勢，分別在6 d和4 d達到最大累積量27.64、33.13 μg/kg，之后逐步下降。而吡蟲啉在肝胰臟中的累積含量一直不高，呈現(xiàn)波動式的輕微增長，施藥28 d后肝臟中吡蟲啉的含量僅為0.75 μg/kg。吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的累積量表現(xiàn)為肌肉>腸道>鰓組織>血淋巴>肝胰臟。

2) 吡蟲啉在稻田底泥和水中的殘留消除情況。如表5所示，吡蟲啉在稻田底泥中的降解呈現(xiàn)梯度式的下降趨勢，在施藥后的第28天，降到10.94 μg/kg。吡蟲啉在稻田水中呈現(xiàn)逐步消解的趨勢，吡蟲啉在水中的降解速度較快，施藥后28 d，吡蟲啉降解率為97.54%。

表4 吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的殘留消除情況 Table 4 Elimination of imidacloprid residues in Procambarus clarki

表5 吡蟲啉在稻田底泥和水中的殘留消除情況 Table 5 Elimination of imidacloprid residues in paddy mud and water

3 討 論

室內暴露試驗結果表明，克氏原鰲蝦暴露在推薦使用濃度下，吡蟲啉的濃度在水溶液中緩慢下降，而吡蟲啉在克氏原鰲蝦各組織的累積量表現(xiàn)為鰓組織>肌肉>血淋巴>腸道>肝胰臟，這與趙冬冬[14]的研究不同，其試驗結果顯示氯氰菊酯在鯽體內的生物富集系數(shù)為鰓>肝臟>肌肉，而有機磷農藥毒死蜱在魚、蟹組織器官中富集，富集量表現(xiàn)為肝臟>鰓>肌肉[15]。魚類富集有機氯農藥的主要途徑之一是通過鰓膜從水中吸收[16]，另一種是通過腸道攝食富集[17]。本試驗證實了鰓富集途徑，克氏原鰲蝦的鰓組織直接暴露在水體，沒有途徑或方式對吡蟲啉進行排泄和轉化，而且密切接觸農藥，所以對吡蟲啉的累積量最大。肝胰臟和肌肉組織表現(xiàn)出相似的累積趨勢，是因為肝臟具有代謝功能，能夠對體內外各種藥物、毒物和體內某些代謝產物等非營養(yǎng)性物質進行生物轉化。毒物經過生物轉化和新陳代謝，可以轉變?yōu)闊o毒或毒性較小易于排泄的物質排出體外。而肌肉里面含有一些種類的代謝相關酶，當吡蟲啉剛剛進入肌肉組織時，就產生應激脅迫，會將吡蟲啉分解為小分子物質或者低毒的其他代謝物。大量試驗證明，當蝦類暴露在毒液中一段時間后，對肝胰臟、鰓組織、腸道、肌肉等實質性器官都會產生毒性作用[18]。肝臟通常是受影響最大、最嚴重的器官；鰓則因其表面積大且與外界直接接觸，易受到有毒物質的侵入和攻擊，損傷的鰓組織會破壞離子調節(jié)功能，從而降低氣體交換效率。所以，本試驗通過室內暴露試驗研究吡蟲啉在克氏原鰲蝦各組織的累積情況，為吡蟲啉田間試驗做了一定的鋪墊。

而室外殘留消除試驗結果表明，吡蟲啉在克氏原鰲蝦中的累積量表現(xiàn)為肌肉>腸道>鰓組織>血淋巴>肝胰臟。吡蟲啉在肌肉中的總累積量最大，這與室內的暴露試驗結果有一定差異，一方面田間試驗處于室外的大環(huán)境下，受天氣溫度影響比較大，另外一方面室外試驗與室內試驗的模擬環(huán)境不同，室外有水草底泥作為克氏原鰲蝦的依附，室內試驗克氏原螯蝦完全暴露在吡蟲啉毒液中。以推薦使用的質量濃度施灑吡蟲啉后，第28天克氏原鰲蝦中肌肉的殘留量為20.44 μg/kg，低于美國規(guī)定吡蟲啉在魚類等水產品中的最大殘留限量(0.05 mg/kg)[19]。日本規(guī)定吡蟲啉在雞、牛、豬等哺乳動物的最高殘留限量為0.02～0.3 mg/kg，但是大量文獻表明吡蟲啉對哺乳動物低毒，而對水產品毒性較大[20-21]。所以，應當制定吡蟲啉在水產品中更加嚴格的最高殘留限量。本試驗施藥后，第28天在稻田水中吡蟲啉降解率為97.54%，而鄭嵐等[11]的試驗結果表明稻田水中的降解速度較快，施藥后21 d，吡蟲啉降解率為93.66%。施藥28 d后，吡蟲啉在底泥中的殘留量為10.94 μg/kg。但是吳聲敢等[22]的試驗結果顯示，10%吡蟲啉可濕性粉劑在土壤中的半衰期高達5.6～15.3 d。雖然吡蟲啉在田水和底泥中降解較快，但是在克氏原鰲蝦組織中代謝較慢，尤其是在可食組織肌肉中。

稻蝦綜合種養(yǎng)模式是稻漁綜合種養(yǎng)中的新興模式。與傳統(tǒng)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖模式相比，蝦蟹套養(yǎng)效益不高、池塘精養(yǎng)模式高溫季節(jié)起捕困難，而稻蝦綜合種養(yǎng)模式的成本投入很低，但養(yǎng)殖效益卻與池塘精養(yǎng)模式不相上下[23]。但值得注意的是，稻蝦綜合種養(yǎng)也比較容易受到農藥污染影響，一是稻田施藥過程中對水體的污染，二是稻田施藥后殘留的農藥污染。但是在現(xiàn)行的評估體系中，農藥對水產品的危害評價并沒有明確。

根據(jù)以上研究結果，為了避免對非靶標生物水產品-克氏原螯蝦產生危害，建議適當延長吡蟲啉在稻田中的施藥間隔期，在靠近養(yǎng)殖水體的稻田尤其是在稻蝦綜合種養(yǎng)模式下應謹慎施藥或建議使用其他替代藥物。