一測多評法測定補骨脂中5種成分的含量

段 麗，祝清燦，汪 娥，孫宜春(國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 550026)

中藥補骨脂為豆科(Leguminosaesp.)植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實，味苦、氣辛、性溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣平喘和溫脾止瀉的功效[1]。在中醫(yī)臨床上主治腎虛泄瀉、遺精、陽萎、尿頻數(shù)、腰膝冷痛和虛寒喘咳等癥?，F(xiàn)代研究表明，補骨脂中含香豆素類、單萜酚類、黃酮類以及苯并呋喃類等多種化學成分，且藥理作用廣泛，具有抗腫瘤、抗菌、抗骨質(zhì)疏松和抗雌激素樣作用等多種藥理活性[2-8]。《中國藥典》2015年版中含補骨脂的成方制劑達41種，但僅以補骨脂素和異補骨脂素的含量為補骨脂的質(zhì)量控制指標[1]。中藥成分復雜，多成分多靶點共同起到防病治病的作用，僅通過檢測其中的個別成分以評價其質(zhì)量略顯不足。多指標同時測定，需要多個對照品[9-13]。一測多評法(QAMS)[14]只需1個對照品，即可同時測定其他成分的含量，可解決某些對照品難以獲得或價格高的問題，具有簡便、高效的特點。本文建立能測定補骨脂藥材中補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚含量的QAMS法，為補骨脂的質(zhì)量、安全性評價和質(zhì)量標準的提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Vanqish型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent 1290型超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；Direct-Pure Genie型超純水系統(tǒng)(上海樂楓生物科技有限公司)。

1.2試藥 補骨脂素(批號110739-201617)、異補骨脂素(批號110738-201617)、新補骨脂異黃酮(批號520052-201401)和補骨脂二氫黃酮對照品(批號520053-201401)，均購于中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)均>99%；補骨脂酚對照品(批號BCY-000053)，購于江西佰草源生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥98%；乙腈和甲醇(色譜純)，購于美國Fisher公司；水為超純水，實驗室自制。實驗用15批補骨脂樣品來源見表1，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學李偉教授鑒定為豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實。

表1 15批補骨脂的樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Zorbar RRHD SB-C18(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Shim-pack XR-ODSⅢ C18(150 mm×2.0 mm，2.2 μm)色譜柱。流動相：乙腈(A)-2 mL·L-1冰醋酸(B)；流速0.4 mL·min-1。梯度洗脫(0～0.5 min，23%A～26%A；0.5～1.2 min，26%A；1.2～1.9 min，26%A～35%A；1.9～5.0 min，35%A～40%A；5.0～8.0 min，40%A～55%A；8.0～10.0 min，55%A；10.0～13.0 min，55%A～75%A；13.0～13.5 min，75%A；13.5～15.8 min，75%A～95%A；15.8～16.5 min，95%A；16.5～18 min，95%A～23%A；18～20 min，23%A)。檢測波長：246 nm；柱溫：45 ℃[15-16]。

2.2溶液的配制

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮對照品13.00，12.50，12.7，10.60 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得4種成分質(zhì)量濃度分別為1.30，1.25，1.27，1.06 mg·mL-1的單一對照品儲備液；取補骨脂酚對照品適量，置于量瓶中，再分別精密量取上述單一對照品儲備液，加甲醇稀釋配制成5種成分質(zhì)量濃度分別為65.00，62.50，44.45，53.00，0.64 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 精密稱取補骨脂樣品粉末(過3號篩)0.5 g，置于索氏提取器中，加甲醇90 mL，水浴回流提取2 h，放冷，移至100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液 取甲醇適量，用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性實驗 分別取2.2項下制備的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，各主成分分離度較好，陰性樣品在相應(yīng)位置上無吸收峰，表明陰性對照無干擾。

根據(jù)航運公司公布的運輸費用、時間及對服務(wù)水平的定性描述，得到各路徑的運輸費用、時間、各路徑對應(yīng)的服務(wù)水平等級等相關(guān)數(shù)據(jù)，具體如表2所示.

圖1 HPLC圖

2.4線性范圍 將2.2.1項下制備的混合對照品溶液加甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，按照2.1項下色譜條件進樣測定，以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積積分值為縱坐標(y)，繪制標準曲線，并進行線性回歸。計算得5種成分的線性方程分別為y1=0.727 7x1+1.186(r1=0.999 9)，y2=0.715 5x2+1.178(r2=0.999 9)，y3=0.448 5x3+0.213(r3=1.000 0)，y4=0.197 5x4+0.214(r4=1.000 0)，y5=0.186 9x5+0.449(r5=0.999 9)。結(jié)果表明，5種成分的質(zhì)量濃度分別在3.20～320.23，2.70～312.91，2.20～219.45，2.72～271.76,1.60～320.68 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實驗 取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次，記錄各色譜峰峰面積并計算RSD值，測得5種成分日內(nèi)精密度RSD值分別為0.23%，0.18%，2.02%，2.20%，0.30%；連續(xù)進樣3 d，每日進樣6次，測得日間精密度RSD值分別為1.38%，1.42%，1.81%，2.02%，0.30%，表明儀器精密度良好。

2.6重復性實驗 取同一批補骨脂藥材(批號20161001)，按照 2.2.2項下方法制備6份供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰峰面積并計算RSD值，結(jié)果5種成分的峰面積RSD值分別為 0.93%，0.94%，0.92%，1.12%，0.57%，表明該方法重復性良好。

2.7穩(wěn)定性實驗 取2.2.2項下制備的供試品溶液，分別于0，1，2，6，8，12，16，24 h按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰峰面積并計算RSD值，測得5種成分的峰面積RSD值分別為0.34%，0.19%，0.45%，2.35%，0.39%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.8回收率實驗 精密稱取已知含量的同批號(批號20161001)補骨脂藥材0.25 g，9份，分別置于索氏提取器中，分別精密加入2.2.1項下制備的混合對照品溶液0.8，1.0，1.2 mL，各3份，使待測目標成分對照品的加入量相當于樣品含有量的80%，100%，120%，加入90 mL甲醇，水浴回流3 h，取出，移至100 mL量瓶中，加甲醇定容，0.22 μm濾膜過濾，按照2.1項下色譜條件進樣測定。記錄各色譜峰峰面積并計算平均回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

2.9相對校正因子(RCFs)的計算 RCFs值的計算公式為[13]：fis=fi÷fs=(Ai÷Ci) ÷(As÷Cs)，式中As為內(nèi)參物的峰面積，Cs為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，Ai為待測成分峰面積，Ci為待測成分質(zhì)量濃度。

取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，分別進樣1，2，5，10，15，20 μL，記錄各成分色譜峰峰面積，分別以補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚為內(nèi)參物，計算其他4種成分的RCFs，取其平均值作為各自的RCFs，對應(yīng)的RSD值分別為0.79%，0.94%，0.98%，0.86%，2.26%。結(jié)果顯示，以補骨脂素為內(nèi)參物，其余待測成分RCFs所對應(yīng)的RSD值最小，且補骨脂素符合內(nèi)參物的篩選原則，故選擇補骨脂素作為內(nèi)參物。

表2 回收率實驗結(jié)果 (n=9)

2.10.1RCFs的重復性 取2.2.1項下制備的混合對照品溶液6份，按照2.1項下色譜條件進樣測定，以補骨脂素為內(nèi)參物，分別計算其余4種成分的RCFs值所對應(yīng)的RSD值。結(jié)果4種成分的RSD值均在0.15%～0.81%范圍內(nèi)，表明RCFs的重復性良好。

2.10.2不同儀器和色譜柱對RCFs的影響 取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件，分別考察Thermo Vanquich UPLC(A)和 Agilengt 1290 UPLC (B)2種色譜儀以及Zorbar RRHD SB-C18(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)(C)和Shim-pack XR-ODS Ⅲ C18(150 mm×2.0 mm，2.2 μm)(D)2種不同色譜柱對RCFs值的影響。結(jié)果顯示，各待測成分RCFs值所對應(yīng)的RSD值均小于2.86%，表明不同色譜系統(tǒng)及不同色譜柱對RCFs無明顯影響。結(jié)果見表3。

表3 不同儀器和色譜柱對RCFs的影響 (n=6)

2.11待測組分色譜峰的定位 取2.2.1項下制備

的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件，分別考察2種色譜儀和2種不同色譜柱(同2.10.2項下)對相對保留值(RRT)的影響。測定并計算4種待測成分與內(nèi)參物補骨脂素的RRT，結(jié)果見表4。由表4可知，各成分RRT所對應(yīng)的RSD值均小于2.65%，表明利用RRT進行不同成分色譜峰的定位是可行的。

表4 不同儀器和色譜柱對RRT的影響 (n=6)

2.12QAMS法與外標法測定結(jié)果的比較 將15批補骨脂藥材按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，各2份，按照2.1項下色譜條件進樣測定。分別采用外標法和QAMS法計算 15 批補骨脂藥材中 5 種成分的含量，結(jié)果見表5。由表5可知，5種成分含量分別在0.26%～0.72%，0.25%～0.63%，0.25%～0.42%，0.14%～0.34%，3.43%～5.92%范圍內(nèi)，經(jīng)t檢驗及配對設(shè)計的Wilcoxon符號秩和檢驗證明2 種方法所測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義；外標法實測值與QAMS法計算值的相對誤差<5%，說明QAMS法可作為補骨脂多指標成分質(zhì)量的評價方法。

表5 補骨脂中5種成分的含量 (n=2)

3 討論

3.1耐用性考察 參考文獻[15-20]進行不同色譜柱、柱溫、流速及液相色譜儀的考察，色譜圖均得到良好重現(xiàn)，分離度、對稱因子等均達到相關(guān)要求。不同柱溫及流速下各待測成分RCFs所對應(yīng)的RSD值均小于0.76%，柱溫流速等對RCFs影響較小。

3.2供試品溶液的制備方法考察 考察了超聲、回流及索氏提取3種方法對提取效果的影響，結(jié)果表明，索氏提取法節(jié)約溶劑且各成分含量均較高，故選擇該方法制備供試品溶液。

3.3評價指標的選擇 通過查閱相關(guān)文獻[2-8]及測定15批補骨脂藥材中5種成分的含量，結(jié)果各批藥材中5種成分的含量均大于0.1%，依據(jù)文獻選擇含量大于0.1%的5種成分作為評價指標[14]，最終確定補骨脂中4種成分對補骨脂素的RCFs分別為:

f異補骨脂素/補骨脂素=1.01，f新補骨脂異黃酮/補骨脂素=0.61，

f補骨脂二氫黃酮/補骨脂素=0.29，f補骨脂酚/補骨脂素=0.28；

RRT值：

r異補骨脂素/補骨脂素=1.06，r新補骨脂異黃酮/補骨脂素=1.68，

r補骨脂二氫黃酮/補骨脂素=1.75，r補骨脂酚/補骨脂素=2.72。

本實驗在進行QAMS法與外標法測定補骨脂中5種成分含量的比較時，首先對補骨脂中5種成分間的RCFs和RRT值進行了驗證，分別采用2種方法對待測成分進行色譜峰定位和含量測定。實驗結(jié)果表明，本實驗所確定的RCFs和RRT結(jié)果準確、可靠，可用于計算補骨脂中其他4種成分的含量。