閻 波, 張 欣, 張 軻, 陳 莉, 田 丹

菲和Cd2+單一及復(fù)合污染對(duì)毛蚶氧化脅迫效應(yīng)的比較

閻 波1, 2, 3, 張 欣1, 張 軻1, 陳 莉1, 田 丹1

(1. 天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院, 天津 300457; 2. 天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300457; 3. 天津市海洋環(huán)境保護(hù)與修復(fù)技術(shù)工程中心, 天津 300457)

采用半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)研究了菲和Cd2+單一及復(fù)合污染下脅迫9 d和清水釋放2 d過(guò)程中毛蚶體內(nèi)活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的變化。結(jié)果表明, 菲和Cd2+單獨(dú)脅迫能誘導(dǎo)毛蚶體內(nèi)ROS含量的增加及GSH含量、GST活性的降低, 且隨染毒濃度的增加, 對(duì)各指標(biāo)影響愈明顯, 存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。毛蚶體內(nèi)GSH和GST的變化趨勢(shì)具有一致性。菲和Cd2+復(fù)合污染對(duì)毛蚶體內(nèi)的氧化脅迫效應(yīng)整體大于二者單獨(dú)污染。在清水釋放階段, 單一及復(fù)合污染脅迫組各指標(biāo)均能恢復(fù)至對(duì)照組水平。表明毛蚶體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)適合作為監(jiān)測(cè)海洋多環(huán)芳烴和重金屬?gòu)?fù)合污染的生物標(biāo)志物。

菲; Cd2+; 復(fù)合污染; 氧化脅迫; 毛蚶

我國(guó)沿海地區(qū)的環(huán)境污染主要表現(xiàn)為有機(jī)物和重金屬污染, 多環(huán)芳烴(PAHs)菲和Cd2+作為有機(jī)物和重金屬污染的典型代表, 在渤海灣海域的生物體內(nèi)均有較高濃度的檢出[1-3]。如鄭關(guān)超等[4]采用高效液相色譜法分析環(huán)渤海地區(qū)養(yǎng)殖水產(chǎn)品中PAHs含量, 其中菲的平均含量最高為6.53 μg·kg–1, 檢出率高達(dá)88.5%。龐艷華等[5]采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)分析大連近岸海域雙殼經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)體內(nèi)重金屬的含量, 并采用單因子評(píng)價(jià)模式對(duì)重金屬蓄積程度進(jìn)行評(píng)價(jià), 發(fā)現(xiàn)部分樣品Cd2+含量超標(biāo)。已有大量研究表明, 菲和Cd2+污染會(huì)對(duì)海洋生物產(chǎn)生一系列有害的化學(xué)作用, 包括通過(guò)增加生物體內(nèi)活性氧或自由基類(lèi)物質(zhì)的濃度[6], 導(dǎo)致機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化防御系統(tǒng)失衡, 從而使之產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng), 甚至造成顯著的毒性影響[7-8]。目前, 單一污染物或同種污染物在海洋生物體中的富集及毒性機(jī)理研究已較為深入[9-10], 但隨著環(huán)境毒理學(xué)研究的不斷深化, 傳統(tǒng)的作用機(jī)制不能用于解釋多種污染物的復(fù)合作用, 對(duì)于多種污染物的影響研究愈加引起廣泛關(guān)注, 閻波等[7]通過(guò)室內(nèi)半靜態(tài)雙箱動(dòng)力學(xué)模型研究了菲和Cd2+單一和復(fù)合污染條件下在毛蚶體內(nèi)的富集動(dòng)力學(xué), 發(fā)現(xiàn)在兩種污染物同時(shí)暴露時(shí), 毛蚶對(duì)菲和Cd2+的吸收富集均有所增強(qiáng)。李定龍等[11]認(rèn)為四溴雙酚A(TBBPA)和鎘對(duì)蚯蚓和斑馬魚(yú)的死亡率均表現(xiàn)為協(xié)同作用。由此可見(jiàn), 復(fù)合污染有其特殊的毒性機(jī)制。并且復(fù)合污染模式的研究更能解決實(shí)際環(huán)境問(wèn)題, 廣泛地開(kāi)展這方面的研究是大勢(shì)所趨。

毛蚶()是重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類(lèi), 普遍生活在我國(guó)渤海海域潮間帶地區(qū)。因其生活在沙質(zhì)淤泥底部、移動(dòng)性差、特殊的濾食特性使它們易受污染物的長(zhǎng)期影響, 并能有效富集海洋中的污染物, 是一種監(jiān)測(cè)海洋污染物生物有效性的指示生物[12]。而毛蚶作為一種美味的海產(chǎn)品, 其生物安全性與人類(lèi)健康息息相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選用毛蚶為研究對(duì)象, 通過(guò)半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn), 觀察不同濃度菲和Cd2+單一污染和復(fù)合污染情況下毛蚶體內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase, GST)活性的變化規(guī)律。以期為揭示海洋生物暴露于復(fù)合污染中而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激毒性提供線索, 并為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

毛蚶購(gòu)于天津市濱海新區(qū)金元寶大型海鮮市場(chǎng), 在實(shí)驗(yàn)室中用海水晶配制的人工海水(鹽度為26)馴養(yǎng)7 d以上用于染毒實(shí)驗(yàn)。馴養(yǎng)在水族箱(60 cm×30 cm× 35 cm)中進(jìn)行, 間斷性曝氣充氧, 水溫控制在(18.0 ± 0.5℃), 用虹吸法每日更換一次養(yǎng)殖用水, 并定時(shí)投喂角毛藻作為食物來(lái)源。馴養(yǎng)期間及時(shí)檢查毛蚶的生命狀態(tài), 取出死亡個(gè)體。毛蚶死亡標(biāo)準(zhǔn): 兩殼長(zhǎng)久張開(kāi)、用探針多次刺激無(wú)張合反應(yīng)。馴養(yǎng)結(jié)束后選擇個(gè)體健康、大小均勻的毛蚶進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn), 本次實(shí)驗(yàn)選用的毛蚶殼長(zhǎng)3±1 cm、殼高2±1 cm、軟組織濕重5.00±1.00 g。

菲(Phenanthrene)為分析純(購(gòu)于美國(guó) Sigma公司, 純度>98%), 用N, N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解, 配制濃度為5 g·L–1的儲(chǔ)備液。重金屬鎘為CdCl2· 2.5 H2O固體, 分析純(購(gòu)買(mǎi)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司), 配制濃度為50 g·L–1的鎘儲(chǔ)備液。DMF為分析純(購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司), 蛋白質(zhì)、ROS、GSH和GST測(cè)試試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分為染毒(9 d)和清水釋放(2 d)兩個(gè)階段。染毒階段將配制的菲和Cd2+儲(chǔ)備液分別稀釋成濃度為菲 50 mg·L–1和Cd2+500 mg·L–1的使用液。各染毒實(shí)驗(yàn)組的濃度設(shè)置如表1所示, 包括空白對(duì)照組和DMF(最大體積比0.01%)對(duì)照組各1組, 菲和Cd2+的單一染毒共4組, 菲和Cd2+復(fù)合染毒1組。實(shí)驗(yàn)在2 L的玻璃燒杯中進(jìn)行, 不同染毒組均設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)期間每24 h更換一次實(shí)驗(yàn)用水(按照設(shè)置濃度), 定時(shí)定量投喂角毛藻。釋放階段將配制的染毒溶液換成未染毒的人工海水進(jìn)行2 d的清水恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

為確定半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)的本底值以及染毒溶液的工作濃度, 分別對(duì)所配制的人工海水及各染毒組溶液中菲和Cd2+的含量進(jìn)行測(cè)定, 其中菲的濃度采用GB/T26411-2010氣相色譜法-質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定, Cd2+的含量參照GB17378.4-2007火焰原子吸收分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 毛蚶生理指標(biāo)的測(cè)定

在半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)的第1、3、5、7、9 d和清水恢復(fù)階段的第2 d采集毛蚶樣品。從各染毒組隨機(jī)取出至少2只毛蚶, 迅速剝除外殼, 取出全部組織, 用生理鹽水(0.86%)除去表層血漬, 瀝干后稱(chēng)重、剪碎, 移至玻璃勻漿器中, 按質(zhì)量(g)︰體積(mL)=1︰9的比例加入4℃預(yù)冷的生理鹽水, 在冰浴中充分勻漿制備成10%的組織勻漿液。經(jīng)冷凍離心機(jī)在4℃、3500 r·min–1下低溫離心10 min, 取上清液置于–20℃待測(cè)。

蛋白質(zhì)含量、ROS、GSH和GST的測(cè)定均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中總蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮蘭法進(jìn)行測(cè)定; ROS含量通過(guò)加入DCFH-DA(2, 7-dishlorofuorescin diacetate)熒光探針測(cè)得, 用各樣品的熒光度值與其蛋白含量的比值表示, 單位為FI·(mg·prot)–1。熒光度值由Synergy 4多功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)測(cè)定; GSH含量通過(guò)采用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應(yīng)產(chǎn)生的黃色化合物比色測(cè)得, 單位為mg·(g·prot)–1; GST活性通過(guò)1-氯-2, 4-2N基苯(CDNB)法測(cè)得, 以每毫克組織蛋白反應(yīng)1 min使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L–1的量為一個(gè)GST活力單位(U), 單位為U·(mg·prot)–1。吸光度值由752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean ± SD)表示, 采用 IBM SPSS Statistics 25 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)和LSD 法對(duì)不同染毒組和組間的平均值進(jìn)行多重比較, 認(rèn)為<0.05時(shí)存在顯著性差異。用Origin 2018軟件對(duì)所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 各染毒組菲和Cd2+工作濃度測(cè)定結(jié)果

所配置的人工海水中均未檢出菲和Cd2+污染。各染毒組溶液中菲或Cd2+的工作濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。將表中各濃度組菲和Cd2+的測(cè)定濃度與設(shè)計(jì)濃度進(jìn)行比較, 其回收率均大于80%, 符合質(zhì)量控制的要求。因此, 我們按照菲和Cd2+的設(shè)計(jì)濃度來(lái)進(jìn)行后續(xù)的分析與討論。

表2 半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)各組測(cè)定濃度

2.2 空白組和DMF組差異性分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)期間所有采樣時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組與DMF對(duì)照組毛蚶體內(nèi)各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)在脅迫實(shí)驗(yàn)和清水釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 空白對(duì)照組和DMF對(duì)照組之間的ROS含量、GSH含量和GST活性均無(wú)顯著性差異(>0.05, 表3), 表明實(shí)驗(yàn)中用作助溶劑的DMF加入量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響, 為保證數(shù)據(jù)的統(tǒng)一性, 因此我們僅采用空白對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

表3 空白組(1)和DMF組(2)毛蚶體內(nèi)各指標(biāo)比較

注: 2*代表清水恢復(fù)階段第2 d。

2.3 菲和Cd2+對(duì)毛蚶ROS含量的影響

菲與Cd2+單一及復(fù)合污染下毛蚶體內(nèi)ROS含量的變化如圖1所示。對(duì)照組毛蚶體內(nèi)ROS含量呈波動(dòng)變化, 范圍為159.84~241.02 FI·(mg·prot)–1。在菲單獨(dú)脅迫下(圖1-a), 除染毒第7 d外, 10 μg·L–1(低)濃度組毛蚶體內(nèi)ROS含量均高于對(duì)照組, 且第1、5 d差異顯著(<0.05), 50 μg·L–1(高)濃度組ROS含量均顯著高于對(duì)照組水平(<0.05)。清水釋放階段, 不同濃度組ROS含量均降至對(duì)照組水平。在Cd2+單獨(dú)脅迫下(圖1-b), 染毒期間, 各濃度組毛蚶體內(nèi)ROS含量均高于對(duì)照組。100 μg·L–1(低)濃度組于染毒第5 d時(shí)升至最大值, 高于對(duì)照組41.62%。500 μg·L–1(高)濃度組于第1 d時(shí)顯著升高(<0.05), 并隨時(shí)間的延長(zhǎng)ROS含量的增加愈明顯, 第5 d后, ROS含量降低, 雖和對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異, 但從數(shù)值上仍高于對(duì)照組。清水釋放階段, 不同濃度組ROS含量均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。在菲和Cd2+復(fù)合脅迫下(圖1-c), 復(fù)合脅迫組ROS含量變化隨染毒時(shí)間的增加而逐漸上升并顯著高于對(duì)照組(<0.05), 第5 d時(shí)達(dá)到最大值, 隨后略有下降直至對(duì)照組水平。我們將單一污染物脅迫組視為陽(yáng)性對(duì)照, 比較發(fā)現(xiàn), 除染毒第9 d外, 復(fù)合脅迫組ROS含量在數(shù)值上均高于菲和Cd2+單獨(dú)脅迫組, 但差異性不顯著。清水釋放階段, 單一和復(fù)合脅迫組ROS含量均降至低于對(duì)照組水平, 且各組之間無(wú)顯著性差異。

2.4 菲和Cd2+對(duì)毛蚶GSH含量的影響

菲與Cd2+單一及復(fù)合污染下毛蚶體內(nèi)GSH含量的變化如圖2所示。對(duì)照組毛蚶體內(nèi)GSH含量呈波動(dòng)變化, 范圍為6.86~10.66 mg·(g·prot)–1。在菲單獨(dú)脅迫下(圖2-a), 染毒初期, 低濃度組毛蚶體內(nèi)GSH含量稍低于對(duì)照組, 且無(wú)顯著性差異(>0.05)。隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng), GSH含量先升高后降低, 在第9 d時(shí)降至最小值, 為對(duì)照組的57.65%。高濃度組GSH含量均顯著低于對(duì)照組, 且在染毒第3 d時(shí), 下降最為明顯, 僅為對(duì)照組的32.24%。清水釋放階段, 各濃度組GSH含量與對(duì)照組相比均略有升高但無(wú)顯著性差異(>0.05)。在Cd2+單獨(dú)脅迫下(圖2-b), 各濃度Cd2+染毒組GSH含量均低于對(duì)照組。染毒第7 d時(shí), 低濃度組誘導(dǎo)毛蚶體內(nèi)GSH含量最低(<0.05), 為對(duì)照組的51.30%。高濃度組GSH含量在染毒前5 d均顯著低于對(duì)照組(<0.05), 隨后毛蚶體內(nèi)GSH含量略有升高, 與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。清水釋放階段, 各濃度組毛蚶體內(nèi)GSH含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。在菲和Cd2+復(fù)合脅迫下(圖2-c), 毛蚶體內(nèi)GSH含量在染毒初期即受到顯著影響, 顯著低于對(duì)照組(<0.05)并持續(xù)至染毒期結(jié)束。與菲和Cd2+單獨(dú)脅迫組相比, 復(fù)合脅迫組毛蚶體內(nèi)GSH含量在第1 d顯著降低(<0.05)。隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì), 但與單獨(dú)脅迫組無(wú)顯著性差異。清水釋放階段, 單一和復(fù)合脅迫組毛蚶體內(nèi)GSH含量均升至對(duì)照組水平。

圖 1 菲和Cd2+對(duì)毛蚶ROS含量的影響

注: 不同小寫(xiě)字母為同一脅迫時(shí)間內(nèi)各濃度組間生化指標(biāo)的多重比較結(jié)果(<0.05); 2*代表清水恢復(fù)階段第2 d, 下同。

圖2 菲和Cd2+對(duì)毛蚶GSH含量的影響

2.5 菲和Cd2+對(duì)毛蚶GST活性的影響

菲與Cd2+單一及復(fù)合污染下毛蚶體內(nèi)GST活性的變化如圖3所示。對(duì)照組毛蚶體內(nèi)GST活性呈波動(dòng)變化, 范圍為5.89~10.62 U·(mg·prot)–1。在菲單獨(dú)脅迫下(圖3-a), 低濃度組毛蚶體內(nèi)GST活性從數(shù)值上均低于對(duì)照組, 但差異不顯著(>0.05), 只有染毒第7 d差異顯著(<0.05), 為對(duì)照組的56.82%。高濃度組GST活性在染毒第3、5、9 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(<0.05), 在染毒末期(9 d)時(shí)降至最小值, 僅為對(duì)照組的45.80%。清水釋放階段, 各濃度組毛蚶體內(nèi)GST活性與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。在Cd2+單獨(dú)脅迫下(圖3-b), 低濃度組僅在染毒初期(1 d)時(shí)對(duì)毛蚶體內(nèi)GST活性有明顯影響, 顯著低于對(duì)照水平(<0.05)。并隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng), GST活性呈先增大后降低的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比, 高濃度組毛蚶體內(nèi)GST活性在染毒第3、7 d時(shí)顯著降低(<0.05), 分別為對(duì)照組的54.39%和41.82%, 并在第5 d時(shí)稍高于對(duì)照組。清水釋放階段, 高濃度組毛蚶體內(nèi)GST活性低于對(duì)照水平, 但無(wú)顯著性差異。在菲和Cd2+復(fù)合脅迫下(圖3-c), 與對(duì)照組相比, 復(fù)合脅迫組在染毒開(kāi)始時(shí)就對(duì)GST活性有顯著影響(<0.05), 并隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng), 下降愈加顯著, 一直持續(xù)至染毒期結(jié)束。復(fù)合組在染毒第3 d時(shí)GST活性顯著低于菲單一脅迫組(<0.05), 在染毒第5、9 d時(shí)顯著低于Cd2+單獨(dú)脅迫組(<0.05)。清水釋放階段, 單一、復(fù)合污染脅迫組與對(duì)照組GST活性之間無(wú)顯著性差異。

圖 3 菲和Cd2+對(duì)毛蚶GST活性的影響

3 討論

當(dāng)生物體處于多環(huán)芳烴、重金屬污染等脅迫環(huán)境時(shí), 機(jī)體可通過(guò)產(chǎn)生活性氧, 如O2–·、H2O2、·OH、NO·等代謝外源傷害, 此過(guò)程會(huì)伴隨產(chǎn)生由未成對(duì)電子構(gòu)成的自由基, 過(guò)量的游離自由基會(huì)造成機(jī)體的過(guò)氧化脅迫, 進(jìn)而誘發(fā)氧化損傷, 甚至造成毒性影響[13-14]。Odzak等[15]研究了金屬對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的毒性, 推測(cè)出ROS含量的增加會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷, 引起機(jī)體抗氧化酶活性的變化。Kang等[16]發(fā)現(xiàn)ROS的含量增加和氧化應(yīng)激作用有關(guān)。因此ROS生成和氧化應(yīng)激可作為解釋機(jī)體受毒性作用的最佳模式[17]。實(shí)驗(yàn)中菲單獨(dú)脅迫使毛蚶體內(nèi)的ROS含量升高, 高濃度組ROS增量整體顯著高于對(duì)照組, 且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系, 展現(xiàn)了較明顯的毒性影響潛力。呂晏鋒等[18]人進(jìn)行的不同濃度菲對(duì)鯉魚(yú)的脅迫實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)ROS增加引起了抗氧化酶活性的變化, 即生物體肝臟組織酶活性表現(xiàn)出低濃度誘導(dǎo), 高濃度抑制的效應(yīng)。在不同濃度Cd2+脅迫下, 毛蚶對(duì)高濃度Cd2+污染更加敏感, 在染毒初期生物體內(nèi)ROS含量就已出現(xiàn)顯著增加。一方面可能與濃度設(shè)置、生物體的敏感性等多種原因造成有關(guān); 另一方面可能與重金屬污染物對(duì)生物體的制毒機(jī)理有關(guān), 具有氧化還原性的重金屬可通過(guò)Fenton 反應(yīng)直接產(chǎn)生活性氧自由基, 無(wú)中間代謝過(guò)程, 從而導(dǎo)致染毒初期ROS含量的明顯增長(zhǎng)[19]。在復(fù)合脅迫染毒期間, ROS增量在數(shù)值上均高于菲或Cd2+單獨(dú)脅迫組, 但無(wú)顯著性差異。一定程度上表明, 在菲和Cd2+復(fù)合染毒脅迫下更加強(qiáng)烈的誘導(dǎo)了毛蚶自身的氧化反應(yīng), 但無(wú)明顯的協(xié)同效應(yīng)。染毒第9 d時(shí)ROS含量明顯降低, 這可能是由于生物體逐漸適應(yīng)外界刺激, 體內(nèi)自我調(diào)節(jié)發(fā)揮作用, 損傷有所恢復(fù), 從而達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。綜上所述, 在本實(shí)驗(yàn)中, 菲和Cd2+單一及復(fù)合脅迫均能引發(fā)毛蚶體內(nèi)ROS含量的升高。ROS含量的升高會(huì)進(jìn)一步觸發(fā)需氧生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng), 來(lái)防止活性氧對(duì)機(jī)體的氧化損傷, 這個(gè)系統(tǒng)主要包含一些能夠被應(yīng)激誘導(dǎo)的酶類(lèi), 如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、GSH和酚氧化酶(PO)等[20]。

生物體中的水溶性抗氧化劑(如: GSH)、抗氧化酶(如: GST)對(duì)外源性毒物具有一定的防御和調(diào)節(jié)能力。其中GSH是一種低分子的抗氧化和自由基清除劑[21], 可以直接清除ROS[22], 同時(shí)也是抗氧化酶GST的底物[23], 其含量的多少常用于衡量機(jī)體抗氧化能力的大小[20, 24]。如計(jì)勇等[25]分析了復(fù)合污染物對(duì)鯽魚(yú)體內(nèi)GSH含量的影響, 發(fā)現(xiàn)指標(biāo)變化存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系, 證明GSH對(duì)外界污染物的生物影響具有敏感性。已有研究表明, 當(dāng)生物體暴露于污染物時(shí), 體內(nèi)自由基增多, 從而消耗GSH, 導(dǎo)致GSH值降低, 如果機(jī)體自身調(diào)節(jié)能力不足導(dǎo)致GSH耗盡時(shí), 會(huì)產(chǎn)生中毒效應(yīng)[26]。GST是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)的一種, 是生物體對(duì)有毒物質(zhì)進(jìn)行Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化酶之一[27], 通過(guò)消除脂質(zhì)過(guò)氧化物ROOH來(lái)降低自由基對(duì)機(jī)體的破壞作用[20]。污染物質(zhì)進(jìn)入生物體后通過(guò)Ⅰ相生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)形成親水性中間產(chǎn)物, 而后通過(guò)Ⅱ相代謝酶(如GST酶)進(jìn)行內(nèi)源性分子結(jié)合, 轉(zhuǎn)化為低毒代謝產(chǎn)物排出體外[28]。GST作為抗氧化酶不僅能夠清除有機(jī)過(guò)氧化物, 在肝臟解毒方面也發(fā)揮著極其重要的作用[20, 29-30]。由于在肝細(xì)胞中分布廣泛, 當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí), GST能很快的被釋放, 其活性的變化常作為解毒能力的敏感指標(biāo)。如張燕寧等[31]研究了廈門(mén)海域石油烴對(duì)僧帽牡蠣體內(nèi)GST活性的影響, 發(fā)現(xiàn)在體外染毒情況下牡蠣與指標(biāo)GST之間相關(guān)性顯著, 可通過(guò)檢測(cè)生物體內(nèi)GST指標(biāo)的變化來(lái)衡量機(jī)體的抗氧化能力。王素敏等[32]在進(jìn)行體外有機(jī)污染物暴露實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)GST對(duì)外界脅迫比較敏感, 可作為污染物早期預(yù)警的生物標(biāo)志物。

在本實(shí)驗(yàn)中, 在菲和Cd2+的單獨(dú)脅迫下, 毛蚶體內(nèi)GSH含量和GST活性整體變化趨勢(shì)一致, 均出現(xiàn)了不同程度的降低, 這種降低趨勢(shì)與ROS的間接作用有關(guān)[33], 說(shuō)明毛蚶在菲或Cd2+的脅迫下大量消耗體內(nèi)GSH和GST, 從而誘發(fā)了機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗氧化反應(yīng)。菲和Cd2+高濃度脅迫時(shí), 對(duì)毛蚶體內(nèi)GSH和GST值影響更為明顯。說(shuō)明隨著污染物濃度的增加, 毛蚶自身調(diào)節(jié)能力愈發(fā)不足, 導(dǎo)致機(jī)體氧化脅迫作用增強(qiáng), 進(jìn)一步加深毒性影響。另外, GSH含量和GST活性變化趨勢(shì)的一致性在一定程度上意味著毛蚶體內(nèi)GSH主要用作底物誘導(dǎo)GST表達(dá), 而不是用來(lái)直接清除ROS, 另一方面也表示毛蚶體內(nèi)這些非酶抗氧化劑和抗氧化酶被共同調(diào)動(dòng)用于抵抗菲和Cd2+暴露帶來(lái)的氧化損傷。我們之前對(duì)菲和Cd2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)毛蚶體內(nèi)SOD、CAT活性和總抗氧化能力(TAOC)水平的影響進(jìn)行過(guò)研究[34-35], 結(jié)果表明在污染脅迫條件下, 這些抗氧化指標(biāo)均不同程度地被誘導(dǎo), 證明了當(dāng)毛蚶在菲和Cd2+單一及復(fù)合脅迫作用下產(chǎn)生了ROS對(duì)機(jī)體造成的損傷時(shí), 可通過(guò)激活體內(nèi)抗氧化酶(SOD、CAT)的活性來(lái)消除過(guò)量的自由基對(duì)機(jī)體的傷害。用于衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況, 既包括酶促系統(tǒng), 如SOD、CAT等, 又包括非酶促系統(tǒng), 如GSH等的綜合性指標(biāo), TAOC水平的誘導(dǎo)也支持了這一現(xiàn)象。結(jié)合本研究結(jié)果, 充分說(shuō)明毛蚶在受到菲和Cd2+單一及復(fù)合脅迫后, 在抗氧化劑和多種抗氧化酶上均可表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng)。清水釋放階段, 這種應(yīng)激反應(yīng)有所緩解, 菲和Cd2+單一及復(fù)合污染脅迫組各抗氧化指標(biāo)均能恢復(fù)至對(duì)照組水平, 這一方面是由于生物體的抗氧化防御系統(tǒng)在發(fā)揮功能, 消除了多余的活性氧; 另一方面可能是由于外源污染物菲和Cd2+經(jīng)代謝逐漸釋放到清水中從而使其毒性作用降低。因此, 毛蚶體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)對(duì)菲和Cd2+污染具有良好的應(yīng)激反應(yīng)敏感性。

同時(shí), 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在菲和Cd2+復(fù)合污染脅迫作用下, 毛蚶體內(nèi)GSH含量和GST活性在染毒期間整體低于單獨(dú)脅迫組, 我們之前對(duì)毛蚶體內(nèi)SOD和CAT指標(biāo)的研究結(jié)果也表明, 菲和Cd2+復(fù)合污染對(duì)毛蚶的氧化脅迫作用大于二者單獨(dú)脅迫[35]。說(shuō)明在復(fù)合污染條件下, 毛蚶不足以調(diào)節(jié)外源污染損傷, 導(dǎo)致抗氧化能力下降, 從而使生物體遭受到較為嚴(yán)重的毒性影響。此研究結(jié)果在非酶氧化劑和多種抗氧化酶方面進(jìn)一步支持了我們先前的研究成果。

綜上所述, 菲和Cd2+單獨(dú)脅迫下, 毛蚶體內(nèi)ROS含量均高于對(duì)照組, 整體呈現(xiàn)出不斷增加趨勢(shì), GSH含量和GST活性均低于對(duì)照組, 整體呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì), 且隨著污染物濃度的增加, 對(duì)各指標(biāo)的影響愈明顯, 存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。毛蚶體內(nèi)GSH含量和GST活性整體變化趨勢(shì)具有一致性, 在一定程度上意味著GSH作為底物大量參與誘導(dǎo)GST的表達(dá)。對(duì)比單一及復(fù)合污染的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 菲和Cd2+復(fù)合污染增強(qiáng)了二者單獨(dú)污染對(duì)毛蚶的氧化脅迫效應(yīng), 表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化損傷。清水恢復(fù)階段結(jié)束后, 單一及復(fù)合污染脅迫組各指標(biāo)均能恢復(fù)至對(duì)照組水平。表明毛蚶體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)適合作為監(jiān)測(cè)海洋多環(huán)芳烴和重金屬?gòu)?fù)合污染的生物標(biāo)志物。

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Comparison of single and combined pollution effect of phenanthrene and cadmium on the oxidative pressure of

YAN Bo1, 2, 3, ZHANG Xin1, ZHANG Ke1, CHEN Li1, TIAN Dan1

(1. College of Marine and Environmental Science, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Key Lab of Marine Resource and Chemistry, Tianjin 300457, China; 3. Tianjin Marine Environmental Protection and Restoration Technology Engineering Center, Tianjin 300457, China)

We conducted a semi-static infected experiment to investigate the reactive oxygen species (ROS) content, glutathione (GSH) content, and glutathione-S-transferase (GST) activities ofafter being exposed to single and combined pollution of phenanthrene (Phe) and cadmium (Cd). The exposure experiment lasted for nine days in pollution media and for two days in clean seawater. The results showed that single exposure of Phe or Cd lead to an increase in the ROS content of, whereas the GSH content and GST activity followed a decreasing trend for the same. Moreover, the impact on biomarkers became more significant with the exposure concentration, thereby indicating a dose-dependent effect. The overall changing trends of GSH and GST ofremained consistent. Additionally, the oxidative stress of combined effect of Phe and Cd onwas higher than the single effect. Furthermore, these biomarkers ofin different exposure groups returned to the control level after the organisms were transferred to the clean seawater for two days. The study results indicated that the antioxidant defense system ofcan act as a suitable biomarker for indicating the combined pollution of polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the marine ecosystem.

phenanthrene (Phe); cadmium (Cd); combined pollution; oxidative stress;

Jul. 20, 2020

Q178.53

A

1000-3096(2021)01-0044-10

10.11759/hykx20200720006

2020-07-20;

2020-08-21

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(15JCYBJC23200)

[The Natural Science Foundation of Tianjin, People’s Republic of China as a key basic research development and planning project, No. 15JCYBJC23200]

閻波(1973-), 女, 河南省安陽(yáng)人, 副教授, 博士, 主要從事環(huán)境污染效應(yīng)研究, 022-60602701, E-mail: yanbo@tust.edu.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)