潘崇南 王星鈞 金輝

[摘要] 目的 探討基于氨基末端激酶（JNK）/p38通路調(diào)控微小RNA-7（miR-7）對幽門螺桿菌（Hp）感染誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌大鼠的干預(yù)作用。 方法 選取60只雄性SD大鼠，15只作為正常組，其余45只建立Hp感染誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌模型，并隨機(jī)分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各15只。上調(diào)組、下調(diào)組做miR-7轉(zhuǎn)染。鑒定miR-7轉(zhuǎn)染效率，比較每組檢出率，測定Th17/Treg相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平及JNK/p38通路蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 與正常組相比，其他三組miR-7、Foxp3、IL-10表達(dá)較低，IL-17A、IL-21、JNK、p38表達(dá)較高（P<0.05）;與模型組相比，下調(diào)組miR-7、Foxp3、IL-10表達(dá)較低，IL-17A、IL-21、JNK、p38表達(dá)較高，上調(diào)組miR-7、Foxp3、IL-10表達(dá)較高，IL-17A、IL-21、JNK、p38表達(dá)較低（P<0.05）。 結(jié)論 上調(diào)miR-7可改善機(jī)體的免疫能力，減緩結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與JNK/p38通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌;幽門螺桿菌感染;氨基末端激酶;微小RNA-7

[中圖分類號(hào)] R587.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）35-0024-03

Intervention of miR-7 on colorectal cancer rats induced by Hp infection based on JNK/p38 pathway analysis

PAN Chongnan1? ?WANG Xingjun2? ?JIN Hui3

1.Department of Infectious Diseases， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou? ?318020， China; 2.Department of Respiratory Medicine， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou? ?318020， China; 3.Department of Gastroenterology， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou? ?318020， China

[Abstract] Objective To explore the intervention effect of microRNA-7 （miR-7） regulated by amino-terminal kinase （JNK）/p38 pathway on colorectal cancer rats induced by helicobacter pylori （Hp） infection. Methods Sixty male SD rats were selected， 15 of them were taken as the normal group， and the other 45 rats were used to establish colorectal cancer models induced by Hp infection， which were randomly divided into model group， up-regulated group and down-regulated group， with 15 rats in each group. The up-regulated group and down-regulated group were transfected with miR-7. The transfection efficiency of miR-7 was identified， the detection rate of each group was compared， and the expression level of Th17/Treg related factors mRNA and JNK/p38 pathway protein were measured. Results Compared with the normal group， the expressions of miR-7， Foxp3， IL-10 were lower in the other three groups， and IL-17A， IL-21， JNK and p38 were higher in the other three groups （P<0.05）. Compared with the model group， the expressions of miR-7， Foxp3 and IL-10 were lower in the down-regulated group， while the expressions of IL-17A， IL-21， JNK and p38 were higher. The expressions of miR-7， Foxp3 and IL-10 were higher in the up-regulated group， while the expression of IL-17A， IL-21， JNK and p38 was lower（P<0.05）. Conclusion Up-regulated miR-7 can improve immunity and slow down the development of colorectal cancer， and its mechanism may be related to JNK/p38 pathway.

[Key words] Colorectal cancer; Helicobacter pylori infection; Terminal kinase; MicroRNA-7

結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐年上升，且死亡率高，故明確直腸癌的發(fā)病機(jī)制有助于早期的診治[1-2]。研究表明[3]，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是胃腺癌的致癌因子之一，腸道菌群在早期的直腸癌形成中扮演著重要角色。微小RNA-7（MicroRNA-7，miR-7）成熟體由23個(gè)核苷酸組成，在腫瘤中具有重要作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移，且miR-7為腫瘤抑制因子，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[4-5]。JNK具有致癌作用，其活化的強(qiáng)度與持續(xù)的時(shí)間不同，可使細(xì)胞的反應(yīng)產(chǎn)生不同結(jié)果。p38為有絲蛋白激酶家族成員，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。本研究分析基于JNK/p38通路調(diào)控miR-7對Hp感染誘導(dǎo)結(jié)直腸癌大鼠的干預(yù)作用，以明確miR-7與Hp感染誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌關(guān)系，為臨床上結(jié)直腸癌的診治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 研究動(dòng)物? 選取60只SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010，體重（289.26±30.79）g，在相對濕度為29%～35%、溫度為（22.96±1.45）℃下飼養(yǎng)1周，每日光照24 h，明暗周期為12 h。本次試驗(yàn)操作均嚴(yán)格參照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，且獲得我院倫理委員會(huì)審批同意。

1.1.2 主要試劑? ELISA試劑盒及相關(guān)試劑（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司）;miR-7模擬物、miR-7抑制物（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）;小鼠抗大鼠JNK抗體（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司），兔抗人p38抗體（上海一研生物科技有限公司），大鼠抗小鼠β-catenin抗體（上海江萊生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模? 選取15只作為正常組，其余45只大鼠參照相關(guān)研究[5]中Hp感染誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的建立方法構(gòu)建模型，采用Hp悉尼株（SS1）液體培養(yǎng)法增菌，凍存菌復(fù)蘇后將其接種于15%馬血清與抗菌藥物布氏肉湯中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為N285%，CO2 10%，O25%，放于37℃下以150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，隨后進(jìn)行革蘭染色觀察細(xì)菌形態(tài)，檢測尿霉素、過氧化氫酶和氧化酶為陽性后，將離心細(xì)菌濃度調(diào)整為1×109 CFU/mL后接種于大鼠，進(jìn)行5%碳酸氫鈉2 mL灌胃，15 min后注入Hp菌液1.5 mL（1×109 CFU/mL），灌胃后所有大鼠禁食12 h，每周感染1次，共5次，最終所有大鼠均建模成功，隨機(jī)分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各15只。

1.2.2 miR-7轉(zhuǎn)染? 將所購買的miR-7模擬物（miR-7 mimic，上調(diào)）、miR-7抑制物（miR-7 inhibitor，下調(diào)）利用Lippofectamine 2000試劑盒稀釋為5 mmol/L，將稀釋后的miR-7模擬物、miR-7抑制物分別注射于上調(diào)組、下調(diào)組大鼠胃組織中，正常組、模型組注射同劑量的生理鹽水，注射24 h后觀察大鼠變化。

1.3 觀察指標(biāo)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定miR-7轉(zhuǎn)染效率。先將每組剩余10只大鼠采集靜脈血3 mL，之后用常規(guī)麻醉提取大鼠結(jié)直腸組織，分成3份，1份做組織切片，其他2份保存于液氮中用于后續(xù)指標(biāo)檢測。對大鼠結(jié)直腸組織進(jìn)行HE染色，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)腸組織中RORγt、IL-17A、IL-21、Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)[6]。Western blot法檢測大鼠結(jié)直腸組織JNK和p38通路蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-7轉(zhuǎn)染效率鑒定比較

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定，下調(diào)組miR-7表達(dá)量降低，上調(diào)組miR-7表達(dá)量升高，說明miR-7轉(zhuǎn)染成功。見表1。

2.2 各組組織學(xué)觀察比較

光鏡下HE染色顯示，正常組與大鼠結(jié)腸黏膜完整，未見明顯炎癥和增生;模型組杯狀細(xì)胞減少，隱窩增厚，黏膜增生;下調(diào)組小鼠結(jié)腸上皮損傷，隱窩結(jié)構(gòu)紊亂，潰瘍形成，較多淋巴細(xì)胞浸潤;上調(diào)組炎癥與潰瘍減少，逐漸恢復(fù)正常。見封三圖1。

2.3 各組Hp檢出率比較

與模型組相比，上調(diào)組Hp檢出率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與下調(diào)組相比，上調(diào)組Hp檢出率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4 各組Th17細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)水平比較

與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組IL-17A、IL-21表達(dá)較高，F(xiàn)oxp3、IL-10表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，下調(diào)組IL-17A、IL-21表達(dá)較高，F(xiàn)oxp3、IL-10較低;上調(diào)組IL-17A、IL-21表達(dá)較低，F(xiàn)oxp3、IL-10表達(dá)較高;與下調(diào)組相比，上調(diào)組IL-17A、IL-21表達(dá)較低，F(xiàn)oxp3、IL-10表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.5 各組JNK/p38信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組JNK、p38表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，下調(diào)組JNK、p38表達(dá)量升高，上調(diào)組JNK、p38表達(dá)量降低，與下調(diào)組相比，上調(diào)組JNK、p38降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

Hp是人類中常見的慢性感染細(xì)菌之一，與多種胃部慢性炎癥、消化性潰瘍及胃癌相關(guān)，是胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素[7-8]。研究表明[9]，Hp與結(jié)直腸癌的發(fā)生具有相關(guān)性，清除Hp感染可有效降低結(jié)直腸癌的發(fā)生。

miR-7有miR-7-1、miR-7-2、miR-7-3三種亞型，位于基因組的不同位置，最后的成熟系列均有相同生物學(xué)活性[10-11]。研究表明[12]，miR-7在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低，可作為鑒別結(jié)直腸良惡性病變的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-7可干預(yù)Hp感染誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌，病理組織觀察顯示，其病變逐漸恢復(fù)正常，結(jié)果提示上調(diào)miR-7具有抗Hp感染誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的作用。

研究顯示，Hp感染影響感染者外周血中Treg細(xì)胞比例，與Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)量增高的結(jié)直腸癌患者預(yù)后差，可通過下調(diào)Th17比例減輕大鼠結(jié)腸炎[13]。IL-21是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞與B細(xì)胞增殖[14]。在結(jié)直腸癌大鼠模型中，Treg細(xì)胞表達(dá)升高，F(xiàn)oxp3是Tregs的影響因子，對Tregs的正常發(fā)育及免疫系統(tǒng)平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用，IL-10為重要的免疫負(fù)向調(diào)節(jié)因子，在很多惡性腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)，不利于惡性腫瘤的免疫治療[15-16]。本研究結(jié)果顯示，Hp感染可降低結(jié)腸組織中Th17細(xì)胞比例，升高Treg細(xì)胞比例，通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞比例減緩結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程。

JNK是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一組絲氨酸蛋白激酶，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡具有調(diào)節(jié)作用[17]。p38為MAPK家族成員，炎癥前因子和應(yīng)激反應(yīng)可使p38磷酸化，激活p38，p38活化后可使多種轉(zhuǎn)錄因子活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示Hp感染后JNK/p38通路蛋白表達(dá)量升高，而上調(diào)miR-7后JNK/p38通路蛋白表達(dá)量降低，結(jié)果表明Hp感染誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生，其機(jī)制與結(jié)直腸癌細(xì)胞中JNK/p38信號(hào)通路被激活有關(guān)，調(diào)控miR-7可影響Hp感染誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

雖然上調(diào)miR-7具有抗Hp感染誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生作用，其作用機(jī)制可能與抑制JNK/p38 通路相關(guān)[19-20]，但僅為本研究結(jié)果，臨床并未有研究分析其關(guān)系，因此本文上述結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證，為Hp感染誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的研究提供新方向。

綜上所述，在對Hp感染誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌大鼠做miR-7上調(diào)處理后，病變明顯被抑制，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)JNK/p38通路失活相關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王慧，任建琳，張功，等. 不同部位結(jié)直腸癌術(shù)后患者生存預(yù)后差異分析[J]. 疑難病雜志，2021，20（5）：440-445.

[2] 田慧香，馬婕群，張彥兵，等. 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及治療中的作用[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2021，27（3）：498-502，507.

[3] 寶令玉，魏倩囡，王慧芹，等. 結(jié)直腸癌Hp感染與COX-2和G-17及PINP的關(guān)系[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2021， 31（4）：569-572.

[4] 劉學(xué)娟，甘海寧，張麗妹，等. 循環(huán)外泌體miRNAs在結(jié)直腸癌中的標(biāo)志作用和臨床轉(zhuǎn)化中的挑戰(zhàn)[J]. 分子診斷與治療雜志，2019，11（3）：157-163.

[5] 羅雨，秦安成，黃海，等. miR-7在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（14）：2740-2745.

[6] 李羅娜，劉蕓，張鴻晨，等. 幽門螺桿菌感染對AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的影響及免疫機(jī)制[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2020，100（34）：2689-2695.

[7] 付保芹，郭成香，王珊珊，等. 胃癌患者血清miR-204、HSP-70及IL-2與Hp感染及病情關(guān)系研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2020，30（7）：1012-1015.

[8] 關(guān)新紅，劉婷婷，蔡倩，等. Hp感染與胃癌組織中P=RC2和H3K 27me3 蛋白的相關(guān)性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2019，29（23）：3539-3543.

[9] Boyuk B，Ozgur A，Atalay H，et al. Helicobacter pylori infection coexisting with intestinal metaplasia is not associated with colorectal neoplasms[J]. Prz Gastroenterol，2019，14（2）：133-139.

[10] 郭靜，許玲芬，孫梅. miR-7調(diào)控腸三葉因子影響腸上皮細(xì)胞增殖和遷移能力[J]. 中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2019， 26（4）：280-283.

[11] Agbu P，Cassidy JJ，Braverman J，et al. MicroRNA miR-7 regulates secretion of insulin-like peptides[J]. Endocrinology，2020，161（2）：40.

[12] Adusumilli L，F(xiàn)acchinello N，Teh C，et al. miR-7 controls the dopaminergic/oligodendroglial fate through Wnt/β-catenin signaling regulation[J]. Cells，2020，9（3）：711.

[13] 張曉紅，南瓊. MicroRNA-7在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)，2019，24（7）：444-446.

[14] 張琳琳，劉益娟，王承黨. 幽門螺桿菌感染對DSS結(jié)腸炎小鼠Th17/Treg細(xì)胞亞群的影響[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2021，33（4）：388-393.

[15] 陽梅，嚴(yán)曉琴，冷亞美，等. 急性髓細(xì)胞白血病患者外周血單核細(xì)胞IL-9、STAT3和miR-21的表達(dá)及意義[J]. 河北醫(yī)藥，2020，42（23）：3538-3542.

[16] 顏春輝，于燕妮，郭莉莉. 結(jié)直腸癌組織STAT3、Foxp3、IL-6表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性[J]. 貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，46（1）：85-90.

[17] 孫志剛，曾寶珠，焦勤書，等. 原發(fā)性肝癌患者索拉非尼聯(lián)合TACE術(shù)治療的有效性及對患者HIF-1α、VEGF、IL-10、IFN-γ的影響[J]. 實(shí)用癌癥雜志，2021，36（5）：810-813.

[18] 閆云靜，王帥，穆云萍，等. FKBP38蛋白對人源子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及侵襲的調(diào)控[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2020，36（8）：1140-1145.

[19] 徐乃喜，趙蕾，呂楊波，等. 幽門螺桿菌感染對誘導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)生的影響及其機(jī)制的動(dòng)物試驗(yàn)研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2019，29（17）：2678-2682.

[20] 信洪利，張艷芝，黃秀蓮. Hp感染對兒童血紅蛋白、胃動(dòng)素和胃泌素水平的影響[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2020， 41（14）：1781-1783.

（收稿日期：2021-07-07）

[基金項(xiàng)目] 浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020KY1044）