唇?bmp2a基因克隆及其與肌間刺骨化相關(guān)性分析

陳 潔 呂耀平 戴慶敏 張 樂 徐傳保 陸 君

(1.麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,麗水 323000;2.麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院,麗水 323000;3.麗水市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,麗水 323000)

多數(shù)淡水魚類,尤其是鯉科魚類都具有一定數(shù)量的肌間刺[1—3]。肌間刺的存在影響了魚肉的食用和深加工。為了去除肌間刺,人們?cè)缭?0世紀(jì)60年代就開展了肌間刺的研究工作[4]。肌間刺是位于椎骨兩側(cè)肌肉中的膜性硬骨,由肌隔結(jié)締組織不經(jīng)軟骨階段直接骨化而成[5,6]。肌間刺的形成開始于間葉細(xì)胞,由間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞[7]。然而,到目前為止,對(duì)于肌間刺的研究工作主要集中于形態(tài)學(xué)方面[3,8],對(duì)其形成的分子機(jī)制研究的較少。

骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorbeta,TGF-β)超家族。目前,已經(jīng)鑒定了30多個(gè)骨形成蛋白[9]。骨形成蛋白是一類具有廣泛生物活性的生長(zhǎng)因子,除具有誘導(dǎo)骨形成功能外,還參與了造血組織發(fā)育、胚胎發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和脂肪生成與代謝等諸多過程[10—12]。在骨形成蛋白家族中,BMP2屬于分泌性多功能蛋白,具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)骨細(xì)胞形成的能力。例如,BMP2在間葉細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞過程中起到重要的調(diào)控作用[13]。目前,bmp2基因已在斑馬魚(Danio rerio)[14,15]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[16]、建鯉(Cyprinus carpiovar.Jian)[17]和金頭鯛(Sparus aurata)[18]等魚類中被克隆報(bào)道。在團(tuán)頭魴中,bmp2基因表達(dá)與肌間刺骨化存在一定的關(guān)系[16]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.2 唇?bmp2a基因cDNA克隆及序列分析

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3 茜素紅染色

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

1.5 免疫組化

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用IBM公司SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 唇?bmp2a基因序列分析

氨基酸多重序列比對(duì)顯示魚類BMP2保守性較高且都具有信號(hào)肽、TGFβ前肽結(jié)構(gòu)域(TGFβ propeptide domain)和TGFβ結(jié)構(gòu)域(TGFβ domain)。在TGFβ結(jié)構(gòu)域中存在一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。此外,包括唇BMP2A蛋白在內(nèi),魚類BMP2蛋白都具有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基。

圖1 基于BMP2蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete amino acid sequences of the BMP2 protein

2.2 唇?尾部肌間刺四個(gè)主要發(fā)育階段的形態(tài)特征

圖2 唇肌間刺骨化的四個(gè)關(guān)鍵時(shí)期Fig.2 Development characteristics of intermuscular bones in the four key development stages of barbel steed

2.3 唇?bmp2a基因組織差異表達(dá)

利用RT-qPCR檢測(cè)bmp2a基因在唇成魚不同組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,bmp2a在被檢測(cè)的組織中均有表達(dá),在鰓中的表達(dá)量最高,肝中次之,在心臟中表達(dá)量最低。在鰓中的表達(dá)量是在心臟中的28.1倍(圖3)。

2.4 唇?BMP2A蛋白在不同組織中的分布

2.5 肌間刺骨化過程中bmp2a基因的表達(dá)

利用免疫組化發(fā)現(xiàn)BMP2A蛋白在肌肉肌隔處有表達(dá),為進(jìn)一步確定bmp2a基因與肌間刺骨化的相關(guān)性,在肌間刺骨化的四個(gè)關(guān)鍵階段,檢測(cè)了尾部肌肉組織中bmp2a基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,唇bmp2a基因隨著肌間刺的骨化其表達(dá)量逐漸升高,與階段Ⅰ比較,bmp2a基因在階段Ⅱ和Ⅲ的表達(dá)量顯著升高,此時(shí)肌間刺正在快速骨化。到了階段Ⅳ,bmp2a基因表達(dá)量有所降低,但與階段Ⅰ比較仍顯著升高,此時(shí)肌間刺已進(jìn)入最終骨化階段(圖5)。

3 討論

BMP2屬于骨形成蛋白家族,是分泌型多功能蛋白,具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)骨細(xì)胞形成的能力。目前,bmp2基因已在斑馬魚[14]、團(tuán)頭魴[16]、建鯉[17]和金頭鯛[18]等魚類中被克隆報(bào)道。在團(tuán)頭魴中,bmp2基因表達(dá)與肌間刺骨化存在一定的關(guān)系[16]。為進(jìn)一步明確bmp2基因與肌間刺骨化的相關(guān)性。本研究克隆得到了唇bmp2a基因cDNA序列。經(jīng)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)魚類BMP2蛋白都具有一個(gè)高度保守的TGFβ結(jié)構(gòu)域,在該結(jié)構(gòu)域中存在一個(gè)N-糖基化位點(diǎn),這一特征表明BMP2蛋白在脊椎動(dòng)物中具有非常保守的功能,特別是與骨發(fā)生和骨形成等細(xì)胞分化相關(guān)[18]。此外,包括唇BMP2A蛋白在內(nèi),魚類BMP2蛋白都具有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基[17,18]。

圖3 唇bmp2a基因組織差異表達(dá)分析Fig.3 The relative expression of bmp2a in different tissues of the barbel steed

圖4 唇BMP2A蛋白在不同組織中的分布Fig.4 Distribution of BMP2A protein in different tissues

圖5 唇bmp2a基因在肌間刺骨化不同階段的表達(dá)Fig.5 Relative expression patterns of bmp2a during intermuscular bone development

BMP2 被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子[28],在骨骼形成的起始和調(diào)節(jié)中具有主要作用[29]。免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)唇BMP2A蛋白分布于肌肉肌隔中。為了進(jìn)一步明確唇bmp2a基因與肌間刺骨化的相關(guān)性,利用RT-qPCR檢測(cè)了唇bmp2a基因在肌間刺骨化的4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示,唇bmp2a基因隨著肌間刺的骨化其表達(dá)量逐漸增加,與階段Ⅰ相比,階段Ⅱ到Ⅳ的表達(dá)量均顯著增加。階段Ⅱ到Ⅲ,肌間刺處于快速骨化階段,bmp2a基因表達(dá)量持續(xù)增加,到了階段Ⅳ,bmp2a基因表達(dá)量有所降低,此時(shí)肌間刺骨化接近于完成。bmp2a基因表達(dá)與肌間刺的骨化時(shí)序相吻合。此外,發(fā)現(xiàn)與階段Ⅰ相比,階段Ⅲ時(shí)bmp2a基因表達(dá)最高,表達(dá)增長(zhǎng)3倍多,而在團(tuán)頭魴中也發(fā)現(xiàn)類似的變化,團(tuán)頭魴bmp家族基因從階段Ⅰ到階段Ⅳ變化倍數(shù)都在2倍左右[16]。雖然變化倍數(shù)不是特別明顯,但是BMP蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族,可通過其受體觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[30],從而對(duì)肌間刺骨化起到一個(gè)較強(qiáng)的調(diào)控作用。