灰葡萄孢對腐霉利的抗性分子機制及快速檢測技術(shù)

鄭 遠, 沈 瑤, 汪漢成, 戴德江,沈 穎, 吳鑒艷, 張傳清*,

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 311300；2. 浙江省植物保護檢疫與農(nóng)藥管理總站，杭州 310004；3. 貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴陽 550081)

由灰葡萄孢Botrytis cinerea 引起的灰霉病是影響草莓產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[1]。灰葡萄孢能夠侵染草莓植株地上部分的所有器官，包括葉片、花瓣、果實等，其中對果實的危害尤為嚴重[2]，造成的產(chǎn)量損失達1 0%～3 0%，嚴重時高達50%以上，甚至絕棚[3]。目前，化學(xué)防治是防治灰霉病的主要手段。腐霉利是一種二甲酰亞胺類殺菌劑 (dicarboximide fungicides，DCFs)，由于其對灰葡萄孢有特效，因此被大量用于果蔬灰霉病的防治[4]，但隨著該藥劑的長期大量、連續(xù)使用，灰葡萄孢對其抗性問題也日益嚴重。相關(guān)抗性報道已有很多：趙虎等研究表明，江蘇省草莓灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率達54%以上[5]；宋晰等研究表明，內(nèi)蒙古灰霉病菌對腐霉利的平均抗性頻率高達90%以上[6]。然而，腐霉利作為浙江省用于草莓灰霉病防治的主要殺菌劑之一，卻鮮有相關(guān)研究報道。因此，明確浙江省草莓灰霉病菌對腐霉利的抗性現(xiàn)狀，對建立合理的用藥策略具有重要意義。

幾種病原菌如灰葡萄孢[7]、鏈格孢Alternaria alternata[8]和粗糙脈孢霉Neurospora crassa[9]等在雙組分組氨酸激酶 (two component histidine kinase，TCHK) 上的突變研究表明，TCHK 是二甲酰亞胺類殺菌劑的主要作用靶點。嚴蕾燕等[10]通過敲除灰葡萄孢TCHK 傳遞系統(tǒng)途徑上5 個關(guān)鍵基因 BcOS1、BcOS2、BcOS4、BcOS5 和BRRG-1，并測定基因敲除突變體的藥劑敏感性發(fā)現(xiàn)，只有BcOS1 基因敲除突變體對DCFs 表現(xiàn)抗性，其他4 個基因敲除突變體對該類藥劑表現(xiàn)更為敏感。因此，嚴蕾燕等認為BcOS1 是DCFs的靶標位點，該基因上的點突變可能會導(dǎo)致病原菌對DCFs 產(chǎn)生抗性。目前報道的灰葡萄孢抗藥性菌株BcOS1 基因上有I365N/R/S、V368F、Q369P/H、N373S 和T447S 等突變類型，其中除了Q369P 突變會導(dǎo)致灰葡萄孢對DCFs 產(chǎn)生低、中或高水平抗性外，其余突變類型均會導(dǎo)致灰葡萄孢對DCFs 產(chǎn)生低水平抗性[11]。

根據(jù)菌絲生長速率法或孢子萌發(fā)法測定病原菌對藥劑的敏感性，是判定灰葡萄孢是否為抗藥性菌株的傳統(tǒng)方法[12]。雖然傳統(tǒng)檢測方法得出的結(jié)果可靠，但是檢測周期長，步驟繁瑣。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是一種操作簡單、精確度高、反應(yīng)速度快且特異性高的檢測方法[13-14]，可以用于檢測特定的病原菌種類。由于作用靶標發(fā)生點突變是目前植物病原菌產(chǎn)生抗藥性的主要機制，因此，近年來已有學(xué)者根據(jù)病原菌抗藥性分子機制，利用堿基錯配原則檢測DNA 片段上單堿基的差異，將LAMP 技術(shù)用于檢測由點突變引起的病原菌對藥劑的抗性[15-17]。

本研究測定了從浙江省5 個地區(qū)采集的200株灰葡萄孢對腐霉利的抗性，分析了抗性分子機制，在此基礎(chǔ)上建立了可以特異性檢測灰葡萄孢對腐霉利高抗基因型的LAMP 檢測技術(shù)，以期為腐霉利的進一步使用及灰葡萄孢的抗藥性治理提供理論依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2017—2018 年從浙江省5 個地區(qū) (寧波市、臺州市、湖州市、杭州市和嘉興市) 的草莓種植基地采集灰霉病樣品，參考杜穎等[11]的方法進行單孢分離純化，共獲得200 株灰葡萄孢，其中寧波50 株，臺州37 株，湖州37 株，杭州32 株，嘉興44 株。將獲得的單孢菌株編號 (地點縮寫 +B + 序號)，保存至斜面凍存管中，于 ?4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試藥劑、試劑與培養(yǎng)基

供試藥劑：95%腐霉利 (procymidone) 原藥由浙江新安化工集團股份有限公司提供。

LAMP 體系試劑：(8 U/μL) Bst DNA Polymerase購自諾唯贊生物科技有限公司；10 × Thermopol Buffer、10 mmol/L dNTP Mix 購自 TaKaRa 生物工程公司、甜菜堿 (Betaine) 和羥基萘酚藍 (HNB) 購自Sigma 公司；25 mmol/L MgCl2購自生工生物工程股份有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：稱取去皮土豆200 g，煮沸后過濾，加入20 g 葡萄糖和20 g瓊脂，加無菌水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，備用。

1.3 灰葡萄孢對腐霉利的抗性檢測

參考趙虎等[5]的區(qū)分劑量法，分別利用5、20 和100 μg/mL 作為灰葡萄孢對腐霉利敏感性水平的區(qū)分濃度。在5 μg/mL 上不能生長的灰葡萄孢是敏感菌株；在5 μg/mL 上能生長、20 μg/mL上不能生長的為低抗菌株；在20 μg/mL 上能生長、100 μg/mL 上不能生長的為中抗菌株；在100 μg/mL 上能生長的為高抗菌株。分別將200 個菌株活化到PDA 平板上，取菌落邊緣的菌餅 (直徑為5 mm) 轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA 平板上，培養(yǎng)3 d 后打取直徑5 mm 的菌餅接種到含不同質(zhì)量濃度腐霉利的PDA 培養(yǎng)基平板上。每個處理重復(fù)3 次。置于23 ℃下黑暗培養(yǎng)3 d 后，統(tǒng)計在含不同質(zhì)量濃度腐霉利PDA 板上生長的菌株數(shù)量，按公式(1) 分別計算灰葡萄孢對腐霉利表現(xiàn)低水平、中水平和高水平抗性菌株的頻率。

式中：X—抗藥性頻率，%；N1—抗藥性菌株數(shù)；N2—供試總菌株數(shù)。

1.4 腐霉利抗感菌株的BcOS1 基因的分析

根據(jù)灰葡萄孢組氨酸激酶基因BcOS1 序列(基因登錄號：AF396827.2)，參考杜穎等[11]的文獻合成4 對引物，記為S1～S4 (表1) 用于擴增BcOS1 基因全長。采用25 μL 反應(yīng)體系，包含以下組分：12.5 μL 2 × Tag 聚合酶，上、下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL。PCR 擴增參數(shù)為：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s；55～62 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min，34 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果由SeqMan 11.2 和EditSeq 7.1 生物軟件進行分析。

1.5 LAMP 引物的設(shè)計

以灰葡萄孢對腐霉利抗性菌株BLB-13 的BcOS1 基因 (基因登錄號：MT375849) 含有Q369P 點突變的序列為模板，使用在線軟件Primer Explore (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html) 設(shè)計檢測引物，記為S5 (表1)。引物干粉用ddH2O 溶解后置于 ?4 ℃冰箱中保存，備用。

1.6 LAMP 擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化

參考胡小然等[18]LAMP 擴增反應(yīng)體系，分別對擴增體系中的各反應(yīng)組分濃度進行優(yōu)化：Bst DNA 聚合酶濃度依次設(shè)為0.08、0.16、0.24 和0.32 U/μL；Mg2+濃度依次設(shè)為 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 mmol/L；dNTP 濃度依次設(shè)為 0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L；FIP 和 BIP 的濃度分別依次設(shè)為 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 和 2.0 μmol/L；F3 和B3 的濃度分別依次設(shè)為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 μmol/L；甜菜堿濃度依次設(shè)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L。每個處理 3 個重復(fù)，試驗重復(fù)3 次，下同。

1.7 LAMP 擴增反應(yīng)條件的優(yōu)化

參考胡小然等[18]LAMP 擴增反應(yīng)條件進行優(yōu)化。將反應(yīng)最優(yōu)體系溶液分別在59、60、61、62、63、64、65 和66 ℃恒溫條件下反應(yīng)60 min，然后在最佳反應(yīng)溫度下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 和80 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)管顏色變化，以確定最佳反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度。

1.8 LAMP 擴增反應(yīng)的靈敏度

利用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒 (上海生物工程有限公司) 提取菌株BLB-13 (高抗) 菌絲DNA，測定其質(zhì)量濃度后進行10 倍梯度稀釋, 用作LAMP 擴增反應(yīng)靈敏度測試的模板。質(zhì)量濃度梯度分別設(shè)置為 10 × 100、10 × 10?1、10 × 10?2、10 × 10?3、10 × 10?4、10 × 10?5、10 × 10?6和 10 ×10?7ng/μL。為了比較 LAMP 和常規(guī) PCR 之間的靈敏度，使用引物F1 和R1 (表1)，擴增BcOS1基因上包含第369 位約1719bp 的DNA 片段，PCR 反應(yīng)程序如1.4 節(jié)所述。

1.9 LAMP 擴增反應(yīng)的特異性

為了評估LAMP 的特異性和準確性，分別以敏感、I365S/N 和Q369P + N373S 突變類型的菌株的DNA 作為模板，每種突變類型各選2 株菌株。在最佳反應(yīng)條件下，通過觀察反應(yīng)管顏色變化判斷LAMP 擴增的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢對腐霉利的抗性

從浙江省5 個地區(qū)采集分離的200 株灰葡萄孢對腐霉利的總抗性頻率高達71.5%，其中低水平抗性菌株 (LR) 100 株，頻率為50%；中水平抗性菌株 (MR) 38 株，頻率為19%；高水平抗性菌株 (HR) 5 株，頻率為2.5% (圖1)。

2.2 腐霉利抗感菌株的BcOS1 序列比對分析

通過比對32 個抗性菌株的堿基序列發(fā)現(xiàn)在BcOS1 基因上存在3 種突變類型 (表2)。低抗菌株和中抗菌株的第365 位密碼子由ATC 突變成AGC或AAC，導(dǎo)致氨基酸由異亮氨酸 (Ile，I) 突變成絲氨酸 (Ser，S) 或天冬酰胺 (Asn，N)；高抗菌株的第369 和373 位密碼子同時發(fā)生突變，導(dǎo)致第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Gln，Q) 突變成脯氨酸(Pro，P)，第373 位氨基酸由天冬酰胺 (Asn，N)突變成絲氨酸 (Ser，S)。

表2 灰葡萄孢BcOS1 堿基序列及氨基酸的比較Table 2 Comparison of base sequence and amino acids of different strains of BcOS1

2.3 LAMP 檢測體系的優(yōu)化

最終確定LAMP 檢測體系的最佳濃度組分(表 3)：Bst DNA 聚合酶為 0.16 U/μL，Mg2+為3 mmol/L，dNTP 為1 mmol/L，內(nèi)引物FIP 和BIP均為 1.2 μmol/L，外引物 F3 和 B3 均為 0.4 μmol/L，甜菜堿為0.6 mmol/L。

表3 LAMP 體系Table 3 LAMP component

2.4 LAMP 檢測體系的反應(yīng)條件

結(jié)果表明：當溫度在59～61 ℃時，反應(yīng)管顏色不變；當溫度到達62 ℃時，反應(yīng)管顏色開始變藍；當溫度到達63 ℃時，反應(yīng)管顏色明顯變藍，因此確定63 ℃為最佳反應(yīng)溫度 (圖2)。在63 ℃下，當反應(yīng)進行50 min 時，反應(yīng)管變化最明顯(圖3)。因此，確定該體系的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度63 ℃、時間50 min。

2.5 LAMP 檢測的靈敏度

以BLB-13 菌株的DNA 為模板，10 倍梯度稀釋DNA。結(jié)果表明：當DNA 質(zhì)量濃度為10 ×10?4ng/μL 時，LAMP 反應(yīng)管顏色仍為紫色，表明此時LAMP 反應(yīng)已檢測不到DNA，說明該檢測體系的最低檢測限為 10 × 10?3ng/μL。而常規(guī)PCR 的最低檢測限僅為 10 × 10?2ng/μL，可見，LAMP 檢測比常規(guī) PCR 的靈敏度高 10 倍 (圖 4)。

2.6 LAMP 檢測特異性

結(jié)果(圖5)表明，敏感菌株、低水平和中水平抗藥性菌株中的Ⅰ類突變和Ⅱ類突變的反應(yīng)管均呈陰性反應(yīng)，顏色無明顯變化，只有高水平抗藥性菌株，即第 Ⅲ 類突變的反應(yīng)管由紫色變?yōu)樘焖{色，表明該LAMP 檢測具有較好的特異性。

3 結(jié)論與討論

灰霉病是影響草莓產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害。二甲酰亞胺類殺菌劑 (DCFs) 腐霉利作為草莓灰霉病防治的主要藥劑之一，有報道指出，草莓灰葡萄孢已對其產(chǎn)生嚴重的抗性[16]，然而浙江省內(nèi)卻缺乏相關(guān)研究報道。本研究通過區(qū)分劑量法測定了浙江省5 個地區(qū)共200 株草莓灰葡萄孢對腐霉利的抗性水平，總抗性頻率為71.5%。與遼寧、山西省等地相比，抗性頻率相對較低[11,19]，這可能與不同地區(qū)施藥水平不同有關(guān)。同時本研究發(fā)現(xiàn)，浙江省灰葡萄孢對腐霉利的抗性菌株以低水平抗性為主，占抗性菌株的69.9%。因此本研究認為，腐霉利可繼續(xù)用于浙江省草莓灰霉病的防治，但前提是要加強灰葡萄孢對腐霉利的抗性監(jiān)測。

Lerous 等[20]通過對雙組分組氨酸激酶(TCHK) 的基因測序比對發(fā)現(xiàn)，田間灰葡萄孢抗性菌株的BcOS1 第365 位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，認為該點突變可能影響了病原菌對二甲酰亞胺類殺菌劑的敏感性。Oshima 等[9]也在灰葡萄孢對該類藥劑的抗性菌株上發(fā)現(xiàn)同樣的突變類型，認為該基因序列的突變導(dǎo)致了菌株對藥劑產(chǎn)生了抗性。本研究通過比對敏感、抗性菌株BcOS1基因序列表明，草莓灰葡萄孢抗腐霉利菌株有3 種突變類型：第Ⅰ類和第Ⅱ類分別為第365 位氨基酸由異亮氨酸 (I) 突變成絲氨酸 (S) 或天冬酰胺(N)，即I365S/N；第 Ⅲ 類包含兩個突變位點，分別為第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Q) 突變成脯氨酸(P) 和第373 位氨基酸由天冬酰胺 (N) 突變成絲氨酸 (S)，即Q369P + N373S。過去已有研究者報道，這3 種突變類型可能是灰葡萄孢對二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因[21-23]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，I365S/N 突變類型菌株的抗性水平為低抗或中抗，而Q369P + N373S 突變類型菌株的抗性水平為高抗。Muhammad 等[21]也報道了 Q369P + N373S 突變會導(dǎo)致灰葡萄孢對腐霉利產(chǎn)生高水平抗性。而杜穎等[11]研究中顯示，BcOS1 基因編碼的氨基酸上發(fā)生Q369P 突變后，菌株不僅表現(xiàn)為低抗，還可能表現(xiàn)中高或高抗。因此N373S 突變在灰霉病菌對腐霉利產(chǎn)生高水平抗性中的貢獻還需進一步研究。

在抗藥性分子機制分析的基礎(chǔ)上，本研究建立了可以快速檢測灰葡萄孢對腐霉利高抗菌株Q369P 的技術(shù)。傳統(tǒng)的抗藥性檢測主要是通過組織或單孢分離的方法分離培養(yǎng)病原菌，再根據(jù)菌絲生長速率法或孢子萌發(fā)法來判定是否為抗性菌株[12]，該方法檢測周期長，步驟繁瑣。后來研究者根據(jù)抗藥性的分子機制設(shè)計錯配引物擴增病原菌的DNA，通過PCR 技術(shù)可特異性區(qū)分敏感和抗藥性菌株[24]，但也存在耗時長、檢測成本高等不足，且不適用于田間的快速檢測。本研究建立的快速檢測體系可在63 ℃恒溫條件下，用時50 min 便可完成整個檢測，并且具有較高的靈敏度，該體系理論上能檢測到低至質(zhì)量濃度為10 ×10?3ng/μL 水平的基因組 DNA，是普通 PCR 反應(yīng)的10 倍。Zou 等[25]報道過一種可在30s 內(nèi)快速提取病原真菌DNA 的方法，在未來可將該方法與LAMP 檢測技術(shù)相結(jié)合，從而實現(xiàn)在田間對灰葡萄孢更為快速、簡單的檢測。