江西省番茄綿疫病菌對嘧菌酯的敏感性檢測及抗性風險分析

何烈干, 鄒 芬, 李湘民, 黃瑞榮, 馬輝剛

(江西省農業(yè)科學院 植物保護研究所，南昌 330200)

番茄綿疫病，又稱褐色腐敗病、番茄掉蛋，是由寄生疫霉Phytophthora parasitica Dast、辣椒疫霉Phytophthora capsici Leonian 或茄疫霉Phytophthora melongenae Sawada 引起的一種卵菌病害[1-2]。該病在世界各地均有分布，一般田塊可導致減產30%～40%，重病田可達60%以上，甚至絕收，經濟損失嚴重[3-5]。番茄為江西主栽蔬菜之一，近年來種植面積大幅增加，但在每年5—6 月份的豐水季節(jié)，綿疫病常暴發(fā)流行，發(fā)生面積數(shù)萬公頃，產量損失達35%以上 (文獻數(shù)據(jù)來源于地方農業(yè)局)。因生產上缺乏有效抗病品種，目前化學防治仍是防治該病的最主要措施[6]。長期以來，甲霜靈一直是防治綿疫病等卵菌病害的特效藥劑，但疫霉菌等易對其產生抗藥性，部分地區(qū)疫霉菌已對該藥產生了抗藥性[7-10]，因此，近年來轉而使用其他類型的殺菌劑來防治該病害。嘧菌酯是先正達公司根據(jù)天然產物strobilurins A 仿生合成的一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其作用機制是通過抑制細胞色素b 和c1 之間的電子傳遞而阻止細胞的ATP 合成，從而抑制其線粒體呼吸而發(fā)揮殺菌作用[11]。嘧菌酯殺菌活性高、殺菌譜廣、持效期長、高效低毒，對卵菌病害具有良好的殺菌活性[12-14]，但由于其作用位點單一，因此，病原菌對其易產生抗性[15]。目前國內外尚未見有關番茄綿疫病菌對嘧菌酯的敏感性報道。為掌握番茄綿疫病菌對該藥抗性現(xiàn)狀，本研究測定了番綿疫病菌對嘧菌酯的敏感性，并對其抗性風險進行分析，以指導田間科學用藥和殺菌劑抗性管理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基

10% V8 培養(yǎng)基：將100 mL V8營養(yǎng)汁、0.2 g CaCO3、900 mL 去離子水和18 g瓊脂粉置于三角瓶中，搖勻，在121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min。待冷卻至60 ℃時倒入培養(yǎng)皿中。

選擇性培養(yǎng)基：待上述培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時，加入利福平20 mg、氨芐青霉素200 mg 和制霉菌素100 mg，混勻，倒入平皿中。

1.1.2 供試菌株 于2018—2019 年在江西于都、安義、萬載、瑞昌、余江、貴溪和樂平等番茄主產區(qū)的綿疫病重發(fā)田塊采集典型病果，先用自來水沖洗3 min，再用滅菌水沖洗。在病健交界處切取0.5 cm × 0.5 cm 方形小塊，經75%酒精和3%次氯酸鈉消毒后置于選擇性培養(yǎng)基上。待形成微小菌落后，在其邊緣切取菌絲塊，移入不含抗菌素的10% V8 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如此重復3 次，得到純培養(yǎng)物。共分離純化得到58 株菌株，根據(jù)形態(tài)學特征和ITS 測序結果，鑒定病原菌均為辣椒疫霉Phytophthoracapsici Leonian。將菌株轉接至試管斜面上，加入滅菌石蠟油覆蓋菌面，在10 ℃左右避光保存?zhèn)溆?。菌株命名采用地名漢語拼音首字母+序號，如YX1 表示永新地區(qū)1 號菌株。

1.1.3 試驗藥劑 96% 嘧菌酯 (azoxystrobin)原藥，由先正達 (蘇州) 作物保護有限公司提供。試驗時先用少許丙酮溶解并配制成質量濃度為100 μg/mL 的母液，待10% V8 培養(yǎng)基溶化后，并冷卻至50 ℃時，加入適量母液，充分振蕩搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，即制得含梯度濃度藥劑的平板。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性檢測 采用菌絲生長速率法[16]測定番茄辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性。先進行預備試驗，將供試菌株活化后轉接到含 0、0.1、1、10、100 μg/mL 嘧菌酯的 10%V8 培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d 后，根據(jù)菌絲生長情況將嘧菌酯質量濃度梯度設置為0.05、0.15、0.45、1.35 和4.05 μg/mL，以不加農藥作為對照。在菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，菌面朝下置于含系列質量濃度嘧菌酯的培養(yǎng)基平板中央。每處理重復3 次。在生化培養(yǎng)箱中于25 ℃黑暗培養(yǎng)5～7 d，當對照中菌落直徑達到7 cm 以上時，用十字交叉法測量各處理的菌落增長直徑，計算抑制率。將抑制率轉化成幾率值，求出毒力回歸方程y = a + bx，根據(jù)毒力回歸方程計算有效抑制中濃度 (EC50) 和相關系數(shù) (r)。

1.2.2 抗性突變體的獲得及抗性水平的測定 將敏感菌株YD5 在10% V8 培養(yǎng)基上于25 ℃下培養(yǎng)7 d 后，在黑暗條件下，將菌落置于距紫外燈 (20 W、波長254 nm) 下方約20 cm 處照射120 s，保持菌落處于黑暗環(huán)境中60 min, 以降低光修復。用直徑為5 mm 的打孔器在菌落邊緣迅速打取菌餅，轉接至含10 μg/mL 嘧菌酯的10% V8 培養(yǎng)基上，立即置于恒溫培養(yǎng)箱中于25 ℃下黑暗培養(yǎng)，能夠迅速生長的為疑似突變體。將這些疑似突變體轉移到不含嘧菌酯的10% V8 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 代，轉接至含 10 μg/mL 嘧菌酯的 10% V8 培養(yǎng)基上驗證其抗藥性。將各抗性突變體轉接至含不同質量濃度嘧菌酯的10% V8 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，計算藥劑對菌絲生長的抑制率 (%)，并求出毒力回歸方程y = a + bx 和 EC50值 (μg/mL)。

根據(jù)各突變體的EC50值與其親本菌株 (YD5)的比值計算抗性倍數(shù)，根據(jù)抗性倍數(shù)將各突變體的抗性水平劃分為敏感、低抗、中抗和高抗[17]，其中：抗性倍數(shù)≤3 的為敏感菌株 (S)；3＜抗性倍數(shù)≤10 的為低抗菌株 (LR)；10＜抗性倍數(shù)≤100 的為中抗菌株 (MR)；100＜抗性倍數(shù)的為高抗菌株(HR)。

1.2.3 突變體的抗性遺傳穩(wěn)定性 將抗性突變體轉接到無藥10% V8 培養(yǎng)基上連續(xù)轉代培養(yǎng)8 代后，分別計算各突變體第2 代、第4 代、第6 代和第8 代對嘧菌酯的抗性倍數(shù)，根據(jù)其抗性倍數(shù)的變化情況，分析抗藥性狀在無藥劑選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4 抗性突變體的生物學性狀

致病力：待抗性突變體和敏感菌株在10%V8 培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)7 d 后，收集游動孢子制成每毫升含104個游動孢子的懸浮液，采用葉片噴霧法于番茄苗期5～6 葉時接種。單個菌株接種10 株，重復3 次。接種后24 h 內保持相對濕度100%、黑暗和25 ℃；此后保持相對濕度75%以上、光暗交替和25～28 ℃。7～9 d后調查病情，比較敏感菌株和突變體的致病力差異。

生長速率及產孢量：在抗性突變體和敏感菌株的菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，菌面朝下置于10% V8 培養(yǎng)基上于25 ℃下黑暗培養(yǎng)，每隔2 d 測量菌落直徑，計算菌株平均生長速率。培養(yǎng)7 d 后用無菌水洗下孢子囊，置于4 ℃冰箱中預冷30 min，促使游動孢子充分釋放，用血球計數(shù)板測定各菌株的游動孢子量。

孢子萌發(fā)率：將相同濃度的抗性突變體和敏感菌株的游動孢子懸浮液 (1 × 104個/mL) 100 μL均勻涂布于水瓊脂培養(yǎng)基上，23 ℃培養(yǎng)24 h 后，在顯微鏡下觀測每個處理的休止孢子，共觀察10 個視野，計算孢子萌發(fā)率。

1.2.5 交互抗藥性測定 采用菌絲生長速率法[18]，測定敏感菌株YD5 及其突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性 (EC50)，分析嘧菌酯抗性突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈是否有交互抗性。

2 結果與分析

2.1 病原菌對嘧菌酯的敏感性

測定了2018—2019 年從江西各地采集分離到的58 個辣椒疫霉菌株對嘧菌酯的敏感性。結果(表1) 表明：嘧菌酯對辣椒疫霉菌絲生長有較強的抑制作用，其 EC50值介于 0.186 7～1.623 9 μg/mL之間，平均 EC50值為 (0.860 6 ± 0.331 8) μg/mL，EC50值最高值與最低值相差8.7 倍，菌株群體對嘧菌酯的敏感性差異不顯著。從EC50值地理分布看，萬載菌株平均EC50值最高，達1.022 2 μg/mL，其次為安義，平均EC50值為0.924 0 μg/mL，瑞昌和于都的最低，平均 EC50值分別為0.739 8 μg/mL和0.737 4 μg/mL，地區(qū)間差異較小。

表1 江西辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性Table 1 Sensitivity to azoxystrobin of Phytophthora capsici in Jiangxi Province

對所測58 個菌株的EC50值進行階段分布劃分，統(tǒng)計每個階段內菌株分布的數(shù)目及頻率。結果顯示 (圖 1)，EC50值在 0.15～0.45、＞0.45～0.75、＞0.75～1.05、＞1.05～1.35 和＞1.35～1.65 μg/mL 的菌株數(shù)分別為 6 株、15 株、21 株、12 株和4 株，分別占樣本總數(shù)的10.34%、25.86%、36.21%、20.69% 和6.90%。從圖中可以看出，58 個菌株對嘧菌酯的敏感性頻率分布呈單峰曲線，接近正態(tài)分布，未出現(xiàn)抗藥性亞群體，因此，本次測定的病原菌對嘧菌酯的平均EC50值(0.860 6 ± 0.331 8) μg/mL，可作為江西省辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性基線。

2.2 抗性突變體的獲得及抗性水平

通過紫外線照射敏感菌株YD5 (EC50值接近敏感基線) 120 s 后，從20 000 個菌餅中獲得4 個抗性突變體 (YD5-1、YD5-2、YD5-3 和 YD5-4)，突變頻率僅為0.02%，說明江西辣椒疫霉對嘧菌酯產生抗性變異的頻率較低。

菌絲生長速率法測定的抗性突變體在含系列質量濃度 (0、1、2、5、20、10 和 20 μg/mL) 嘧菌酯V8培養(yǎng)基上的生長量結果見表2。4 個突變體的 EC50值在 4.452 1～7.812 1 μg/mL 之間，抗性倍數(shù)介于5.3～9.3 之間，均屬于低抗水平。

表2 辣椒疫霉抗性突變體對嘧菌酯的敏感性Table 2 Sensitivity to azoxystrobin of resistant mutants of Phytophthora capsici

2.3 突變體的抗性遺傳穩(wěn)定性

經紫外線照射得到的4 個低抗性菌株YD5-1、YD5-2、YD5-3 和YD5-4，在無藥培養(yǎng)基上連續(xù)轉代培養(yǎng)8 代后發(fā)現(xiàn)，各抗性菌株的抗性水平變化不顯著，抗性倍數(shù)均介于3～10 之間，仍為低抗菌株 (表3)，說明上述4 個突變體的抗性能穩(wěn)定遺傳。

表3 番茄辣椒疫霉突變體對嘧菌酯抗性遺傳穩(wěn)定性Table 3 Genetic stability of resistance to azoxystrobin in the mutants of Phytophthora capsici

2.4 抗性突變體的生物學性狀

從表4 可以看出：除突變體YD5-4 的致病力低于親本菌株外，其余突變體與親本菌株YD5 的致病力間不存在顯著性差異；突變體YD5-2 的生長速率與親本菌株相當，其余3 個突變體均顯著下降；在產孢量方面，突變體YD5-3 與親本菌株不存在顯著性差異，而突變體YD5-1、YD5-2 和YD5-4 的產孢量顯著低于親本菌株，說明抗藥性產生后其無性繁殖能力有明顯變化；親本菌株與所有抗性突變體的孢子萌發(fā)率不存在顯著差異性。

表4 抗藥突變體與親本菌株間生物學性狀比較Table 4 Comparison of biological traits between resistant mutants and their parent

2.5 交互抗藥性

采用菌絲生長速率法測定了敏感菌株YD5及其4 個嘧菌酯抗性突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性。結果表明，4 個抗性突變體對烯酰嗎啉的抗性倍數(shù)為0.8～1.4，對甲霜靈的抗性倍數(shù)為0.8～1.3。4 個突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性表現(xiàn)一定程度的降低或增加，說明嘧菌酯與烯酰嗎啉和甲霜靈之間均不存在交互抗性 (表5)。

表5 突變體和敏感菌株YD5 對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性比較Table 5 Sensitivity comparison of resistant mutants and susceptible strain YD5 to dimethomorph and metalaxyl

3 結論與討論

本研究結果表明：2018—2019 年從江西省番茄主產區(qū)采集分離得到的58 個辣椒疫霉菌株對嘧菌酯仍有較高的敏感性，其對嘧菌酯的敏感性基線為 (0.860 6 ± 0.331 8) μg/mL。58 個菌株的菌絲生長對嘧菌酯的敏感性頻率呈正態(tài)分布，田間未出現(xiàn)抗性菌株，這與Emil 等[19]、Qin 等[20]和姜彥全等[21]關于疫霉菌的研究結果相符。鑒于此，目前江西地區(qū)仍可使用嘧菌酯防治綿疫病。但辣椒疫霉具有易變異性等特點，長期使用單一藥劑有產生抗藥性的風險，應定期加強田間菌株的抗藥性監(jiān)測，掌握病原菌的敏感性變化動態(tài)，適時制定防治策略。

為評估辣椒疫霉對嘧菌酯的抗性風險，本研究通過紫外線照射敏感菌株，成功誘導出4 個低抗菌株，未獲得中、高抗菌株，抗性突變率為0.02%。對突變體的抗藥性進行遺傳穩(wěn)定性分析，發(fā)現(xiàn)經過8 次轉代培養(yǎng)后，其抗性水平變化不顯著，抗性能夠穩(wěn)定遺傳，且突變體的致病力與親本菌株不存在顯著性差異，多數(shù)突變體的生長速率與產孢量均顯著低于親本敏感菌株，而在孢子萌發(fā)率方面兩者不存在顯著性差異。綜上可知，雖然目前生產上江西辣椒疫霉尚未出現(xiàn)抗嘧菌酯菌株，但存在抗性突變體產生的可能性，且這種抗性遺傳很穩(wěn)定，不易喪失，突變體致病力也不減弱，由此推斷，病菌對嘧菌酯的抗性風險為中等，因此，生產上應該注意對嘧菌酯抗性的管理，應注意輪用或換用作用機理不同殺菌劑。

針對目前生產上常見的交互抗藥性問題，本研究選用生產上防治番茄綿疫病的常規(guī)藥劑烯酰嗎啉和甲霜靈與嘧菌酯進行交互抗藥性分析，證實嘧菌酯與烯酰嗎啉和甲霜靈間均不存在交互抗性。郭梁等[22]和李成斌等[23]研究認為，疫霉菌對甲霜靈和嘧菌酯不存在交互抗性；袁善奎等[18]研究表明，疫霉菌對嘧菌酯和烯酰嗎啉無交互抗性。張海良等[24]測定了江西辣椒疫霉菌對甲霜靈的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)，108 個菌株均為敏感菌株，未出現(xiàn)抗藥性病原菌亞群體，且在生產中甲霜靈對卵菌病害防效較為顯著。因此，建議生產上可將該藥劑與烯酰嗎啉、甲霜靈以及其他作用機理不同的殺菌劑混用或交替使用，以緩解殺菌劑對抗藥性的選擇壓力，延長藥劑的使用期限。