PLIN2通過(guò)調(diào)控SREBP2促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積*

蔣思怦， 張 瑞， 李曉歌， 張 榮， 郭東銘， 袁中華

（南華大學(xué)心血管疾病研究所，動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省動(dòng)脈硬化性疾病國(guó)際科技創(chuàng)新合作基地，湖南衡陽(yáng)421001）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今未被完全闡明，其中脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)被廣泛認(rèn)為是誘導(dǎo)AS 發(fā)生發(fā)展的原因。低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）經(jīng)氧化修飾［氧化LDL（oxidized LDL，ox-LDL）］后被巨噬細(xì)胞所吞噬，轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，大量堆積在血管內(nèi)皮下，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成與發(fā)展［1］。脂滴包被蛋白2（perilipin 2，PLIN2）是圍繞在細(xì)胞內(nèi)脂滴表面的主要脂滴相關(guān)蛋白之一，高表達(dá)在泡沫細(xì)胞中［2-3］，對(duì)脂滴的合成和降解起著重要的作用，可作為脂質(zhì)蓄積的標(biāo)志。大量研究表明，PLIN2 具有一定的促進(jìn)AS作用［4］，但其具體機(jī)制尚未闡明。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋 白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）是一類可激活涉及膽固醇、甘油三酯等生物合成及脂質(zhì)代謝所需酶轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其中SREBP2廣泛存在于各種組織，主要參與膽固醇代謝酶轉(zhuǎn)錄的調(diào)控［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞動(dòng)態(tài)的膜細(xì)胞器，一旦受到有害因素（如饑餓、病毒感染等）侵襲，大量的錯(cuò)誤折疊及未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)募集，將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。新近研究表明，PLIN2敲除小鼠的ERS 受到顯著抑制，同時(shí)肝臟中SREBPs 活性降低，血清脂質(zhì)蓄積水平減少，SREBP2 表達(dá)降低［6］，提示 PLIN2 與ERS 和SREBP2 活性具有密切聯(lián)系。我們前期研究顯示，PLIN2 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞中脂滴聚積［7］。因此，本研究旨在探討PLIN2 是否通過(guò)影響ERS 調(diào)控SREBP2的表達(dá)，從而影響巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

材 料 和 方 法

1 主要材料

RAW264.7小鼠單核/巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞來(lái)自上海生科院細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI1640 培養(yǎng)液（蘇州巨能世紀(jì)公司）；新生胎牛血清（杭州四季青公司）；ox-LDL（廣州奕源公司）；游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）檢測(cè)試劑盒（Applygen）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Omega Bio-tek）；SYBR Green 和Trizol（TIANGEN）；4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA；北京索萊寶公司）；Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑（上海碧云天公司）；油紅O（北京鼎國(guó)昌盛公司）；鼠抗3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）Ⅰ抗（武漢愛(ài)博泰克生物技術(shù)有限公司）；鼠抗β-actin Ⅰ抗，兔抗PLIN2、SREBP2 和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）Ⅰ抗，山羊抗鼠/抗兔IgG Ⅱ抗（Proteintech）；其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將RAW264.7 細(xì)胞置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到75%時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)分為4 步。實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞經(jīng) ox-LDL 處理不同時(shí)間（0、6、12、24 和48 h），構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型［8］。實(shí)驗(yàn)二：（1）PLIN2 過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，分為 PLIN2-Con 組（將 pQCXIP 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞）、PLIN2-Con+ox-LDL 組、HA-PLIN2 組（將 pQCXIP-HAAdipophilin 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞）和 HA-PLIN2+ox-LDL 組；（2）PLIN2沉默實(shí)驗(yàn)，分為siRNA-Con 組（將pSuperscramble siRNA 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞）、siRNA-PLIN2 組（將pSuper-Adipophilin siRNA 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞）、siRNAPLIN2+ox-LDL 組和 siRNA-Con+ox-LDL 組。實(shí)驗(yàn)三：分為HA-PLIN2 組及siRNA-PLIN2 組。實(shí)驗(yàn)四：ERS抑制劑4-PBA 處理實(shí)驗(yàn)，分為control 組（空白對(duì)照組）、ox-LDL組、4-PBA組和ox-LDL+4-PBA組。

2.2 提取與鑒定質(zhì)粒 將含pQCXIP、pQCXIP-HAPLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 質(zhì)粒的菌液解凍混勻，接種在含氨芐西林的瓊脂培養(yǎng)基上，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h后挑出陽(yáng)性單菌落置于含氨芐西林的LC 培養(yǎng)液中，37℃搖床震蕩18～24 h（220 r/min）。取一部分菌液提取質(zhì)粒并通過(guò)AGE 鑒定，余下已鑒定的菌液再劃板挑取陽(yáng)性單菌落接種于200 mL的LC培養(yǎng)液中，通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒的濃度。

2.3 轉(zhuǎn)染pQCXIP、pQCXIP-HA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 入 RAW264.7細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前1 d 將RAW264.7 細(xì)胞接種于6 孔板中，后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。用250 μL 的DMEM 培養(yǎng)液稀釋上面提取的pQCXIP、pQCXIPHA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 質(zhì)粒（各 4 μg），并用 250 μL DMEM 培養(yǎng)液稀釋10 μL Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑，均在室溫下靜置5 min 混勻，后又置于室溫中20 min，將混勻液均勻加入6 孔板中。再于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h 后換為含10%胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，1～2 d后可通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 將收集好的未處理的RAW264.7 細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)染后的RAW264.7 細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解混合液冰上裂解，提取總蛋白。使用BCA 試劑盒對(duì)蛋白定量。制備10%分離膠和5%濃縮膠，蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后經(jīng)脫脂牛奶封閉，后分別加入相應(yīng)Ⅰ抗，搖床震蕩孵育6～8 h（4℃過(guò)夜）；接著加入對(duì)應(yīng)的Ⅱ抗，搖床搖動(dòng)孵育2 h（室溫），開(kāi)始顯影。

2.5 油紅O 染色 配制油紅O 工作液（油紅O 儲(chǔ)存液∶雙蒸水=6∶4），使用4%多聚甲醛（30 min）固定細(xì)胞后使用 PBS 洗滌 3 次，每次 10 min；將油紅 O 染液加入24 孔板中，每孔至少1 mL，1 h 后吸出染液，PBS再洗滌3次，每次10 min；后用蘇木素染核5 s，最后用PBS洗滌3次。在顯微鏡下拍片并保存。

2.6 細(xì)胞免疫熒光 使用4%多聚甲醛（30 min）固定細(xì)胞，PBS清洗3次；使用0.1%Trition X-100（每孔300～500 μL）處理24 孔板中的細(xì)胞15～30 min，PBS清洗 3 次，每次 5 min；使用 300～500 μL 的 10% 胎牛血清封閉1 h 后孵育對(duì)應(yīng)的Ⅰ抗（4℃過(guò)夜），PBS 清洗3 次，每次5 min；接著Ⅱ抗孵育（常溫），PBS 清洗3 次，每次 5 min；使用 1 mg/L 的 DAPI 染核 30 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；最后使用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下拍攝并保存。

2.7 細(xì)胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分中FC 的測(cè)定 （1）提取細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：細(xì)胞懸浮后1 000×g離心10 min，丟棄上清液；加入500 μL 試劑A 后放于冰上10 min，將勻漿在 1 000×g和 11 000×g（4℃）下分別離心5 min 和10 min，收集上清液；后于30 000×g（4℃）條件下離心 45 min，收集沉淀；加入 400 μL 的試劑 B 在30 000×g（4℃）下再次離心45 min，收集的沉淀即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品。（2）檢測(cè)FC：在培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶和制備的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分中分別加入150 和100 μL 的裂解混合液，2 000×g離心5 min 后收集30 μL 上清液，余下裂解液使用BCA 法進(jìn)行蛋白定量；將5 nmol/L 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品以無(wú)水乙醇稀釋后設(shè)置濃度梯度；96 孔板中每孔加入190 μL R1+R2 工作液（R1∶R2=4∶1），后每孔分別加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照溶液或待測(cè)樣品（37℃，20 min）；使用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔吸光度（A），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出膽固醇濃度，再用蛋白濃度進(jìn)行校正。

2.8 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，按照Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，去除其中混雜的DNA 及DNase，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，合成第 1 鏈 cDNA 采用20 μL 體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 15 min，95℃ 3 min。50 μL 兩步法 PCR 程序?yàn)椋?5℃ 15 min；95℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 25 s，40 個(gè)循環(huán)。以 β-actin 為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算SREBP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行制圖和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ox-LDL 處理不同時(shí)間對(duì)SREBP2和PLIN2蛋白水平的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h 內(nèi)，ox-LDL 呈時(shí)間依賴性增加PLIN2 和SREBP2 表達(dá)水平（P＜0.05），但 24 h 后 SREBP2 蛋白水平開(kāi)始降低，見(jiàn)圖1；同時(shí)24 h后出現(xiàn)細(xì)胞死亡、偽足增多現(xiàn)象，見(jiàn)圖2。因此，本研究選擇ox-LDL孵育細(xì)胞時(shí)間為24 h。

2 PLIN2對(duì)SREBP2和HMGCR 表達(dá)、脂質(zhì)蓄積及FC含量的影響

Western blot 及 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PLIN2-Con 組相比，HA-PLIN2 組 PLIN2 和 SREBP2的mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平顯著上升（P＜0.05）；與 PLIN2-Con+ox-LDL 組相比，HAPLIN2+ox-LDL 組 PLIN2 和 SREBP2 的 mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平顯著增加（P＜0.05），圖3A 及圖4A、B。與siRNA-Con 組相比，siRNA-PLIN2組PLIN2和SREBP2 的mRNA 和蛋白水平及HMGCR的蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與siRNA-Con+ox-LDL 組相比，敲減PLIN2可顯著逆轉(zhuǎn) ox-LDL 誘導(dǎo)的SREBP2 mRNA和蛋白水平及HMGCR蛋白水平的升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3B及圖4C、D。

Figure 1.Western blot was used to determine the protein levels of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages exposed to ox-LDL for different time（0，6，12，24 and 48 h）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 h.圖1 ox-LDL處理不同時(shí)間對(duì)PLIN2和SREBP2蛋白表達(dá)的影響

Figure 2.Micrograph of RAW264.7 macrophages cultured with ox-LDL for different time（A：0 h；B：24 h；C：48 h）.The death of the cells increased after ox-LDL treatment for 24 h.The scale bar=100 μm.圖2 ox-LDL處理不同時(shí)間后細(xì)胞的形態(tài)

油紅O 染色結(jié)果顯示，HA-PLIN2+ox-LDL 組較ox-LDL 組脂質(zhì)蓄積增加，而 siRNA-PLIN2+ox-LDL 組較ox-LDL組脂質(zhì)蓄積減少，見(jiàn)圖5。

FC檢測(cè)結(jié)果顯示，與siRNA-PLIN2+ox-LDL組相比，HA-PLIN2+ox-LDL組細(xì)胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的FC含量均顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

3 PLIN2 對(duì) GRP78 蛋白水平及 SREBP2 核移位 的影響

Western blot結(jié)果顯示，HA-PLIN2組細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)較siRNA-PLIN2組顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

免疫熒光結(jié)果顯示，與control 組相比，siRNAPLIN2組綠色熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)，在核內(nèi)很少表達(dá)，而HA-PLIN2組細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)熒光，見(jiàn)圖8。

4 ERS抑制劑4-PBA對(duì)GRP78、SREBP2和HMGCR表達(dá)的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4-PBA 組 GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平較control 組顯著降低（P＜0.05）；與 ox-LDL 組 相比 ，4-PBA+ox-LDL 組GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖9。

RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4-PBA 組 SREBP2 的mRNA 水平較control 組降低（P＜0.05）；與 ox-LDL 組相比，4-PBA+ox-LDL 組SREBP2 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖10。

討 論

隨著人民生活的日益提高，AS源性心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅著人們身心健康。但AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中脂質(zhì)代謝異常是導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一［9］。相關(guān)研究表明，PLIN2能夠增加巨噬細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇酯含量，抑制膽固醇流出，促進(jìn)膽固醇蓄積及泡沫細(xì)胞形成［7，10］。同時(shí)也有報(bào)道證實(shí)，在AS 斑塊區(qū)域，PLIN2 表達(dá)顯著增加［11］，提示PLIN2 可能通過(guò)促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成進(jìn)而影響AS 發(fā)生發(fā)展。但是PLIN2 調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積的具體機(jī)制仍不明確。本研究表明，PLIN2 能夠通過(guò)ERS 調(diào)控 SREBP2 表達(dá)和活性，促進(jìn) HMGCR 表達(dá)和膽固醇合成，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

Figure 3.Effects of PLIN2 on the protein levels of SREBP2 and HMGCR.A：the RAW264.7 macrophages were transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h；B：the RAW264.7 macrophages were transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PLIN2-Con group；#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group；&P＜0.05 vs ox-LDL group；▲P＜0.05 vs siRNA-Con group；△P＜0.05 vs siRNA-PLIN2 group；☆P＜0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.圖3 PLIN2對(duì)SREBP2和HMGCR蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.Effects of PLIN2 on the mRNA expression of SREBP2.A，B：the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h；C，D：the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PLIN2-Con group；#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group；&P＜0.05 vs ox-LDL group；▲P＜0.05 vs siRNA-Con group；△P＜0.05 vs siRNAPLIN2 group；☆P＜0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.圖4 PLIN2對(duì)SREBP2 mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.Lipid droplets in RAW264.7 macrophages detected by oil red O staining.The scale bar=50 μm.圖5 油紅O染色觀察PLIN2對(duì)脂滴變化的影響

既往研究表明，細(xì)胞內(nèi)膽固醇豐富時(shí)，SREBPs錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；但細(xì)胞膽固醇水平較低時(shí)，SREBPs被site-1 及site-2 蛋白酶切割并釋放，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與LDL 受體或HMGCR 合成酶的基因操縱子結(jié)合并促進(jìn)其表達(dá)［5，12］。其中，SREBP2 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為膜結(jié)合蛋白，可通過(guò)蛋白酶水解后釋放N 端結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞核，與固醇反應(yīng)元件結(jié)合，激活SREBP2 靶基因HMGCR的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成。Vergnes 等［13］發(fā) 現(xiàn)，在 小鼠 胚胎 中 敲除SREBP2，HMGCR 表達(dá)水平顯著降低，膽固醇的生物合成減少。新近研究報(bào)道，在小鼠中敲除PLIN2能夠降低SREBP2 表達(dá)，抑制其活性，減少脂質(zhì)蓄積［6］，提示PLIN2 與SREBP2 存在相互作用，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究顯示，在RAW246.7 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PLIN2，能夠促進(jìn)并激活 SREBP2，增加SREBP2 核移位，上調(diào)HMGCR 表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上FC水平，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)蓄積；降低PLIN2 水平則出現(xiàn)相反的結(jié)果。這說(shuō)明PLIN2 可通過(guò)激活SREBP2 增加HMGCR 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成進(jìn)而引起細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

Figure 6.Effects of PLIN2 on intracellular free cholesterol content（A）and free cholesterol content in endoplasmic reticulum（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs siRNA-PLIN2+Ox-LDL group.圖6 PLIN2對(duì)細(xì)胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上游離膽固醇含量的影響

Figure 7.Effects of PLIN2 on the protein level of GRP78 detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group.圖7 PLIN2對(duì)GRP78蛋白水平的影響

Figure 8.Effects of PLIN2 on the nuclear translocation of SREBP2 detected by immunofluorescence staining.PLIN2 was visualized by FITC-conjugated Affinipure（green），and nuclei were stained with DAPI（blue）.The scale bar=50 μm.圖8 PLIN2對(duì)SREBP2核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 9.Effects of 4-PBA on the protein levels of GRP78，SREBP2 and HMGCR in each group detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs 4-PBA group；△P＜0.05 vs ox-LDL group.圖9 4-PBA對(duì)GRP78、SREBP2和HMGCR蛋白水平的影響

Figure 10.Effects of 4-PBA on the mRNA expression of SREBP2 in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs 4-PBA group；△P＜0.05 vs ox-LDL group.圖10 4-PBA處理后對(duì)SREBP2 mRNA表達(dá)的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)膽固醇含量的重要細(xì)胞器［14］，通過(guò)感知細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量而調(diào)節(jié)胞內(nèi)膽固醇水平［15］。ERS 發(fā)生能夠促進(jìn)膽固醇負(fù)荷，增加脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成，說(shuō)明ERS 與AS 發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系［16-17］。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，在調(diào)節(jié)ERS的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是ERS的標(biāo)志［18］。ERS發(fā)生時(shí)，ERS 相關(guān)蛋白 GRP78 與 SREBP 裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）-SREBP復(fù)合物分離，激活SREBP2，促進(jìn)其發(fā)揮生物活性［19］。此外，Chen 等［20］觀察到 PLIN2 在胰腺 β 細(xì)胞中可參與ERS 調(diào)節(jié)。由此我們猜想，PLIN2 可能通過(guò)ERS調(diào)控SREBP2 從而影響RAW264.7 巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。本研究表明，過(guò)表達(dá)PLIN2 能促進(jìn)GRP78 表達(dá)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PLIN2 能夠引起ERS 的發(fā)生。ERS 特異性抑制劑 4-PBA 降低 SREBP2 及 HMGCR 表達(dá)，進(jìn)一步表明PLIN2可通過(guò)ERS 影響SREBP2活性，從而調(diào)控RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

綜上所述，PLIN2可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，其機(jī)制是其誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，激活SREBP2，從而促進(jìn)脂質(zhì)蓄積。但鑒于本工作是以RAW264.7 巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，與臨床疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的區(qū)別，因此在AS 發(fā)展中PLIN2 對(duì)SREBP2的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。