p300/p53/Smad3通路參與人心房成纖維細胞衰老相關(guān)心房纖維化*

賴穎瑜 ， 高小燕 ， 周慧珊 ， 李 昕 ， 王釗煜 ，彭德威 ， 饒 芳 △， 鄧春玉 ，3△

（1南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510515；2廣東省心血管病研究所心內(nèi)科，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州510080；3華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

衰老是隨著壽命增長所發(fā)生的一個不可避免的過程，而心房纖顫（簡稱房顫，atrial fibrillation，AF）是臨床上最常見的心律失常之一，也是一種“老年病”，其發(fā)病率隨年齡增長而增加，但目前治療效果仍不理想，其發(fā)病機制需要深入研究。心房結(jié)構(gòu)重塑是AF 的主要發(fā)病機制之一，心房纖維化是其主要特征。研究表明衰老與心房纖維化密切相關(guān)，與年齡較大者（＞70歲）相比，年齡較小者（＜50歲）右心耳纖維化明顯減少，年齡是影響纖維化發(fā)生的主要因素之一［1］。在快速起搏誘發(fā)AF 的動物模型中發(fā)現(xiàn)，與成年組相比，老年犬左心房纖維化更嚴重［2］，但衰老相關(guān)心房纖維化的具體分子機制尚未完全闡明。

轉(zhuǎn)錄輔激活因子p300 是一種細胞內(nèi)普遍存在的核磷酸蛋白，具有內(nèi)在的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，在細胞增殖，凋亡和胚胎發(fā)育中都發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，p300參與纖維化，如在特發(fā)性肺纖維化患者的肺成纖維細胞中，p300 明顯上調(diào)，而抑制p300 能減輕纖維化［4-5］；p300 還影響細胞衰老，研究顯示在微血管內(nèi)皮細胞中，高糖誘導(dǎo)的沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）下調(diào)，p300 表達上調(diào)，導(dǎo)致細胞快速衰老［6］。我們的前期研究結(jié)果也顯示，p300 隨著體外培養(yǎng)的小鼠心臟成纖維細胞衰老而升高，伴隨有纖維化指標的增加［7］。因此，p300可能參與心臟衰老相關(guān)纖維化的病理過程。

Smads 是纖維化通路的重要信號分子［8］，衰老通路中的重要因子p53 也與纖維化相關(guān)［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，在人腎小管上皮細胞株HK-2 和角化細胞株Ha-CaT中，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β 1，TGF-β1）通過調(diào)控p53 活性進而促進 p53 與Smads相互作用，隨后結(jié)合到纖溶酶原激活物抑制因子1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）啟動子上，導(dǎo)致纖維化［11］。而 p300 可通過乙?；{(diào)控 p53［12］。這些研究提示，p300 可通過調(diào)控p53，促進p53-Smad3相互作用進而參與衰老相關(guān)纖維化。

因此，本研究采用人心房成纖維細胞（human atrial fibroblasts，HAFs）作為研究對象，通過傳代建立細胞衰老模型，比較不同代數(shù)的細胞中p300、p53、Smad3 和其他衰老及纖維化相關(guān)因子的變化，并通過干預(yù)p300 的表達，觀察其對p53 和Smad3 等衰老和纖維化指標的影響，探索p300 在衰老相關(guān)纖維化中的作用及其可能機制，以期發(fā)現(xiàn)治療衰老相關(guān)心房纖維化的新靶點。

材 料 和 方 法

1 患者組織標本

本研究收集患者于心臟體外循環(huán)手術(shù)中或經(jīng)胸腔鏡AF 外科消融手術(shù)中需切除的心耳組織，分離培養(yǎng)原代心房成纖維細胞并進行傳代培養(yǎng)。所有患者均簽署知情同意書，并獲廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）倫理委員會批準，批準號為No.GDREC2016128H。有肺炎或者其他感染性疾病的患者不入選。

2 試劑

特級澳洲胎牛血清和0.25% 胰蛋白酶-EDTA（Gibco）；成纖維細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（fibroblast basal medium，F(xiàn)BM）（Lonza）；p300 小發(fā)卡（small-hairpin，sh）RNA 質(zhì)粒和 p300 過表達質(zhì)粒 pCMV p300 CHA（吉凱基因）；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）；姜黃素（Cayman）；蛋白 Marker（Fermentas）；4×蛋白上樣緩沖液（BIO-RAD）；RIPA 裂解液（強）（Beyotime）；抗p300 抗體（Millipore）；抗I 型膠原蛋白α1 鏈（collagen type I α1 chain，Col1A1）抗體和抗Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈（collagen type Ⅲ α1 chain，Col3A1）抗體（Abcam）；抗基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（matrix metalloproteinase-2/9，MMP-2/9），p21 和 p16 抗體（Santa Cruz）；抗p53，Smad3，p-Smad3，GAPDH，PAI-1 和 TGF-β 抗體及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（senescence-associated βgalactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒（Cell Signaling Technology）；其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 方法

3.1 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 人心耳組織經(jīng)PBS 漂洗后去除多余脂肪組織和內(nèi)外膜，加入幾滴FBM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），細剪成約1 mm ×1 mm ×1 mm 小塊，用吸管將組織塊均勻涂布于25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面上，靜置約15 min，輕翻培養(yǎng)瓶從側(cè)面加入4 mL FBM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），培養(yǎng)面朝上于37 ℃，5%CO?的培養(yǎng)箱中靜置2 h，組織塊貼牢后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)面朝下放置使培養(yǎng)基浸過所有組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔5 d換液，待細胞游離、生長至基本融合成片達瓶底80%后，進行消化傳代。傳代至P3 和P7 的細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度達70%～80%，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒按說明操作進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒稀釋液：125 μL Op-ti-MEM 培養(yǎng)基稀釋 2.5 μg 質(zhì)粒和 5 μL P3000 試劑，輕輕混勻；脂質(zhì)體稀釋液：125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋 6 μL Lipofectamine 3000 試劑，高速震蕩 3 s 混勻。然后將這兩份分別含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育15 min，均勻滴加到細胞新鮮更換的1 mL FBM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，輕輕搖勻，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d。

3.2 SA-β-Gal 染色 β-半乳糖苷酶是衰老細胞的標志物。將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，待密度達到50%～70%，按試劑盒操作說明進行SA-β-Gal 染色。棄培養(yǎng)基后用PBS 漂洗1 次。加入固定液室溫固定15 min，去除固定液后PBS 漂洗2次。按照說明配制染色液，調(diào)節(jié)pH 值為6，每孔加1 mL 染色液，密封，于37 ℃，無CO2的干燥恒溫箱孵育過夜。在顯微鏡下觀察，核周藍染的即為衰老細胞。

3.3 Western blot實驗 細胞棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次后加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液（強），冰上裂解5 min，用刮刀刮細胞，用移液槍收集細胞混合物至 EP 管中，冰上繼續(xù)裂解 20 min。4 ℃，12 000 r/min 離心15 min，取上清分裝至EP 管，儲存于-80 ℃。BCA法測定蛋白濃度。加入4×蛋白上樣緩沖液稀釋30 μg 蛋白，55 ℃煮 10 min。行 8%～10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。蛋白面向上用5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h。TBST 洗3 次，每次5 min。加入稀釋好的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗3次，每次5 min。加入稀釋好的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，每次5 min。蛋白面朝上均勻滴加ECL孵育30 s，平鋪在托盤上送入機器自動曝光。

3.4 細胞免疫熒光染色 待細胞密度達到70%～80%時，用預(yù)溫PBS 洗2 次。4%多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗 3 次，每次 10 min。0.2% TritonX-100通透20 min，4%BSA 封閉30 min，去除封閉液直接滴加稀釋好的Ⅰ抗放入濕盒，4 ℃孵育過夜。PBS 浸洗3 次，每次10 min。滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗，濕盒中避光室溫孵育45 min。PBS 浸洗3 次，每次10 min。避光滴加封片劑（含DAPI）后在熒光顯微鏡下觀察。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 分析處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較用t檢驗。多組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)的兩兩比較采用 LSD-t或 SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同代數(shù)人心房成纖維細胞SA-β-Gal 染色結(jié)果以及p300、p53 和Smad3 等衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的變化

體外培養(yǎng)的HAFs 連續(xù)傳代至P11 代，行Western blot 檢測不同代數(shù)（P3、P7 和P11）細胞的 p300、p53和Smad3等衰老和纖維化相關(guān)因子的蛋白水平，結(jié)果如圖1A、1B所示，隨著細胞代數(shù)增加，p300和衰老相關(guān)因子p53表達水平逐漸升高，以P11代細胞最高（P＜0.05；P＜0.01）。與P3 代細胞相比，P7 代細胞的p21 和p16 表達水平都明顯升高（P＜0.01），且p16在P11 代達最高水平（P＜0.01）。Smad3 是公認的促纖維化因子，隨著細胞傳代，總Smad3 有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，p-Smad3 的蛋白水平在P7 和P11代細胞中均明顯增高（P＜0.05），其他纖維化指標MMP-2/9 和PAI-1 表達均隨著代數(shù)逐漸增加，以P11代細胞最高（P＜0.01），但Col1A1和Col3A1的表達在各組間無明顯差異，TGF-β 在P11 代細胞中表達較P3 和P7 有所下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異。另外，分別取P3、P7和P11代細胞進行SA-β-Gal染色，觀察細胞衰老情況，結(jié)果如圖1C 所示，隨著傳代代數(shù)增加，核周藍染的衰老細胞逐漸增加（P＜0.01）。由此可見，隨著 HAFs 衰老，p300 和 p53 表達增加，Smad3 被激活，一些纖維化相關(guān)因子表達增加。

2 姜黃素處理高代數(shù)人心房成纖維細胞對衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的影響

為了進一步探索p300 在HAFs 衰老以及衰老相關(guān)的纖維化中的作用，我們給予不同濃度（6、9 和12 μmol/L）的 p300 抑制劑姜黃素處理高代數(shù)（P7）HAFs，使用 Western blot 檢測細胞中 p300、p53 和Smad3 以及其他衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的變化。結(jié)果如圖2 所示，不同濃度姜黃素處理后，P7 代細胞的p300 水平呈現(xiàn)濃度依賴性下降（P＜0.05），以12 μmol/L 濃度處理組達最低水平（P＜0.01）；衰老相關(guān)指標p53、p21 及p16 表達水平也呈逐漸下降趨勢，Smad3 及p-Smad3 的蛋白水平明顯下降，以高濃度處理組下降最為明顯（P＜0.05）；其他纖維化指標Col1A1、MMP-2、TGF-β 和PAI-1 在高濃度姜黃素（12 μmol/L）處理后，亦明顯下降（P＜0.05；P＜0.01）；而Col3A1 和MMP-9 的蛋白水平也有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。因此，p300 抑制劑姜黃素處理抑制高代數(shù)HAFs的p300，可明顯降低衰老和部分纖維化因子的蛋白水平，提示p300 在HAFs 衰老和纖維化中發(fā)揮著重要作用。

3 敲減p300 的表達對高代數(shù)人心房成纖維細胞衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的影響

為了確定p300 在HAFs 衰老相關(guān)的纖維化中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，我們對高代數(shù)（P7）細胞進行p300 shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲減p300的表達，觀察衰老和纖維化相關(guān)因子的變化，結(jié)果如圖3 所示。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后p300 的表達水平下降（P＜0.05），伴隨p53、Smad3 及p-Smad3 的蛋白水平顯著降低（P＜0.01），同時其他纖維化相關(guān)指標如Col1A1、Col3A1 和MMP-2 的蛋白水平也降低（P＜0.05；P＜0.05），MMP-9、TGF-β 和PAI-1 水平也有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。由此說明，敲減HAFs 的p300表達可以抑制衰老及纖維化相關(guān)因子的分泌。

Figure 1.The results of SA-β-Gal staining and the protein expression levels of p300，senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of different passages.A：the protein levels of p300，Smad3/p-Smad3，p53/p21 and p16；B：the protein expression of Col1A1/3A1，MMP-2/9，TGF-β and PAI-1；C：the images of SA-β-Gal staining（×100）and SA-β-Gal positive rate of HAFs at passage 3，passage 7 and passage 11，respectively.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs P3 group.圖1 不同代數(shù)人心房成纖維細胞SA-β-Gal染色結(jié)果及p300、衰老和纖維化相關(guān)蛋白的表達水平

Figure 2.Effect of curcumin on the expression of p300，senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of passage 7.A：the protein levels of p300，Smad3/p-Smad3，p53/p21 and p16 before and after treated with curcumin of different concentrations（6，9 and 12 μmol/L）；B：the protein expression of Col1A1/3A1，MMP-2/9，TGF-β and PAI-1 before and after treated with curcumin.Mean±SEM. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group.圖2 姜黃素處理對人心房成纖維細胞p300及衰老和纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

4 人心房成纖維細胞過表達p300 對衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的影響

對低代數(shù)（P3）HAFs進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達p300，觀察衰老和纖維化相關(guān)指標的變化，結(jié)果如圖4 所示，轉(zhuǎn)染后p300 的表達顯著增加（P＜0.05），p53 和Smad3 的水平也明顯升高（P＜0.05），纖維化指標MMP-2的水平也隨p300而增加（P＜0.05），而Col1A1無明顯變化。此部分研究結(jié)果顯示，低代數(shù)的HAFs過表達p300，可促進衰老和纖維化相關(guān)因子的分泌。

討 論

以上研究結(jié)果表明，隨著HAFs 衰老，p300 及其他衰老和纖維化相關(guān)因子水平升高；姜黃素處理或p300 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲減p300的表達可降低p53和Smad3 的表達，抑制細胞衰老和纖維化相關(guān)因子分泌；而過表達p300 則可促進細胞衰老和纖維化相關(guān)因子分泌，說明p300 在HAFs 衰老相關(guān)纖維化中起重要作用，可能通過調(diào)控p53/Smad3通路參與其相關(guān)病理機制。

心臟纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，相關(guān)病理因素包括，遺傳因素，代謝障礙，肥胖和高血壓等。近年來研究表明，除卻病理因素，衰老亦會導(dǎo)致心肌細胞外基質(zhì)的改變，如心臟成纖維細胞的增殖和膠原蛋白含量增加，交聯(lián)增強，導(dǎo)致心臟順應(yīng)性下降［13］。AF 的主要病理機制包括心房肌細胞的電重塑和結(jié)構(gòu)重塑，心房纖維化是結(jié)構(gòu)重塑的主要表現(xiàn)。而進行性心房纖維化亦與心臟衰老相關(guān)［14］，與年幼大鼠相比，老年大鼠的左房纖維化增加，且具有更高的 AF 誘發(fā)性［15］。因此，AF 的發(fā)生率隨年齡的增長而增加，與增齡相關(guān)的心房纖維化有關(guān)，心房組織呈現(xiàn)年齡依賴的間質(zhì)纖維化，心肌細胞間的電通訊受阻，異位或折返活動的可能性增加，使老年人容易發(fā)生AF［15］。目前雖然衰老相關(guān)的心房纖維化研究已獲關(guān)注，但其相關(guān)機制尚未得到很好闡明。因此，本研究以HAFs 為研究對象通過傳代建立復(fù)制性細胞衰老模型，探究其相關(guān)機制。

轉(zhuǎn)錄輔激活因子p300 是體內(nèi)重要的表觀遺傳調(diào)控分子，具有內(nèi)的在乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，可通過乙?；M蛋白和非組蛋白參與調(diào)控多種基因的表達［3，16］。研究表明，p300 可調(diào)控膠原蛋白表達，促進纖維化，如在糖尿病大鼠心肌肥厚模型中，p300 通過調(diào)控 Smad2 乙?；?，增加 TGF-β 活性，促進膠原合成，導(dǎo)致心肌纖維化和肥厚［17］；p300 HAT 特異性抑制劑—L002 在體內(nèi)和體外均能有效抑制纖維化反應(yīng)，如減弱體外培養(yǎng)的人心臟成纖維細胞分化，增殖，遷移及膠原合成能力，逆轉(zhuǎn)高血壓誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化和肥大［18-19］。雖然，直接關(guān)注p300 在細胞衰老中作用的研究不多，但在人原代包皮成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)，p300 對原癌基因Ras誘導(dǎo)的細胞早衰至關(guān)重要，抑制p300 活性可阻止p53 活化，有助于腫瘤轉(zhuǎn)移中的衰老逃逸［20］。而在人臍帶來源的間充質(zhì)基質(zhì)細胞中，敲減p300的表達或抑制其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性將誘導(dǎo)細胞早衰并降低增殖潛能，提示p300 通過激活p53/p21 信號途徑，在誘導(dǎo)細胞衰老過程中起重要作用［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，p300 的表達水平隨著HAFs 傳代代數(shù)的增加而升高，同時伴隨其他衰老和纖維化相關(guān)因子增加。姜黃素處理或p300 shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲減p300的表達可抑制衰老信號通路和纖維化因子分泌，而過表達p300 則相反。由此證實p300 在HAFs 衰老相關(guān)纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究還對p300 參與衰老相關(guān)纖維化的分子機制進行初步探索。p53 是一種序列特異性DNA 結(jié)合蛋白，是調(diào)控細胞增殖，凋亡和衰老的重要轉(zhuǎn)錄激活子［22］。乙?；钦{(diào)控p53 功能的關(guān)鍵共價修飾，乙酰轉(zhuǎn)移酶p300 介導(dǎo)的p53 乙?；粌H可增加其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，還可以增強其反應(yīng)性基因，如細胞周期依賴性激酶抑制劑p21等的啟動子激活促進細胞周期停滯或衰老［23］，這可能是p300 參與細胞衰老的重要途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激可通過Sirt1/p300/p53/p21 途徑誘導(dǎo)持續(xù)的內(nèi)皮細胞衰老［24］。同時，p53與Smad3都是纖維化反應(yīng)的效應(yīng)因子［25］，在 TGF-β1 刺激腎纖維化中 p53 與 Smad3 有明顯協(xié)同作用，p53 通過與受體激活的Smads 結(jié)合而充當(dāng)TGF-β1 誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中的輔助因子和TGF-β1 纖維化反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子［26］，促進腎纖維化疾病進展。本研究中也發(fā)現(xiàn)，p300 隨著細胞傳代而增加，且在過表達p300 時，p53 和Smad3 的活性隨之增加，并伴隨纖維化因子增加；降低p300水平后，p53 和Smad3 的水平也下降，同時纖維化因子分泌減少。因此，p300可能通過調(diào)控p53和Smad3參與衰老相關(guān)纖維化。

Figure 3.The protein levels of senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of passage 7 after p300 shRNA transfection.The protein levels of p300，p53，Smad3/p-Smad3，Col1A1/3A1，MMP-2/9，TGF-β and PAI-1 in passage 7 HAFs after transfected with p300 shRNA plasmid were determined by Western blot.Mean±SEM. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 高代數(shù)（P7）人心房成纖維細胞敲減p300的表達對衰老和纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 4.The protein levels of senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of passage 3 after p300 over-expression.The protein levels of p300，p53，Smad3，Col1A1 and MMP-2 in passage 3 HAFs after transfected with p300 over-expression plasmid were determined by Western blot.Mean±SEM.n=4.*P＜0.05 vs vector control group.圖4 低代數(shù)（P3）人心房成纖維細胞過表達p300對衰老和纖維化相關(guān)因子表達的影響

此外，本研究具有以下局限性：雖然我們發(fā)現(xiàn)敲減p300的表達可明顯降低纖維化相關(guān)因子，如Col 1A1/3A1 和 MMP-2 的 表 達 ，同 時 p53 和 Smad3/p-Smad3 的水平亦明顯降低，而p300 過表達后p53 和Smad3 水平明顯升高，纖維化指標MMP-2 的表達亦明顯增加，但對Col 1A1 的表達無明顯影響。其原因可能是因為本研究中的HAFs來源于人體心房組織，均為接受心臟手術(shù)的患者，其心房可能均有一定程度的病理改變，在這個基礎(chǔ)上分離的心房成纖維細胞可能已有一定程度的纖維化，導(dǎo)致其膠原的表達已經(jīng)比較高，故過表達p300 不能使膠原合成進一步增加。

綜上所述，本研究初步證實p300 可能通過激活p53/Smad3 通路參與人心房成纖維細胞衰老相關(guān)心房纖維化，最終導(dǎo)致AF的發(fā)生和發(fā)展。