柚皮素對心肌缺血/再灌注損傷大鼠PI3K/AKT信號通路和內質網(wǎng)應激及其相關凋亡通路的影響*

蘭 卓， 王 歡， 何夕松， 游麗萍， 徐 楠， 馮 健， 李家富

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內科，四川瀘州646000）

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是指短期內恢復缺血心肌的血流反而使缺血心肌的損傷加重的病理現(xiàn)象［1］，常見于心肌梗死的再灌注治療（溶栓和PCI）和心臟體外循環(huán)手術中，很大程度上降低了心血管疾病治療的效果。因而，改善心肌I/R 損傷的藥物研究一直都是心血管領域的熱門和難題。

凋亡被認為是心肌I/R 損傷重要的潛在機制之一，內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是一種細胞凋亡調控途徑，PI3K/AKT 信號通路則是一條經(jīng)典的抗凋亡通路［2］。已有研究表明，PI3K/AKT 信號通路的激活可以通過調控ERS 及其相關凋亡通路從而減輕心肌I/R損傷［3-5］。

柚皮素（naringenin，NAR）是一種富含多種生物活性的黃酮類化合物，且廣泛存在于柑橘類水果中，被大量用于預防動脈粥樣硬化、高血壓、心律失常等多種心血管疾病的研究中［6-7］。研究顯示，在心肌I/R損傷的不同模型中，NAR 均具有保護作用［8-10］。本實驗擬在明確NAR 減輕大鼠心肌I/R 損傷的基礎上，探討NAR 對內質網(wǎng)應激及其相關凋亡通路和PI3K/AKT信號通路的影響，為其臨床應用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 相關藥物及試劑

柚皮素（N164488）和 LY2940029（L124970）購自Aladdin；心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自ELK Biotechnology；TUNEL試劑盒購自Roche；抗cleaved caspase-3、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、caspase-12、p-PI3K 和 GAPDH 抗體購自 Abcam；抗葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）和p-AKT 抗體購自 CST；TTC 染色液、HRP 標記山羊抗兔Ⅱ抗和BCA蛋白質濃度測定試劑盒購自ASPEN。

2 實驗設計

2.1 動物飼養(yǎng)、分組及給藥 SPF級健康雄性SD大鼠48 只［6～8 周齡，體重180～200 g；購自成都達碩實驗動物公司，許可證號為SCXK（川）2015-030］適應性飼養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分成假手術組（sham組）、模型組（I/R 組）、柚皮素處理組（NAR 組）和柚皮素處理+LY294002 組（NL 組），每組 12 只。NAR 組和NL組造模前1周開始腹腔注射NAR（100 mg/kg），每天1次；sham組和I/R組給予等體積生理鹽水；NL組在造模前30 min另外腹腔注射LY294002（0.3 mg/kg）。

2.2 模型建立及處理 參照王春艷［11］實驗方法，首先用戊巴比妥鈉（45 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠；然后行氣管插管術，連接小動物呼吸機人工通氣；接著行開胸手術，尋找冠狀動脈左前降支并在其近段下方穿線結扎阻斷血流（sham 組僅穿線不結扎），可見左心室前壁光澤度降低，顏色變蒼白；造成心肌缺血30 min 后恢復血流再通120 min；再灌注結束后，每組隨機取6只大鼠腹主動脈血用于檢測cTnI，每組取一半（6 只）大鼠心臟組織制成切片用于TTC 染色、HE 染色和TUNEL 染色，另一半大鼠心臟組織迅速凍存用于RT-qPCR和Western blot檢測。

3 檢測指標和方法

3.1 cTnI 檢測 按說明書的方法和步驟，用Rat TNNI3 ELISA Kit檢測血清中cTnI的濃度。

3.2 心肌組織病理學 用4%甲醛固定心肌組織24 h，然后進行脫水、石蠟包埋，接著將樣本切成5 μm 厚，采用HE 染色，最后在光鏡下隨機選取3 個視野觀察并拍片記錄。

3.3 心肌梗死面積 取出心臟樣本，用PBS 溶液洗凈后將心臟切片（約2 mm 厚），然后用2%的TTC 溶液染色20 min（白色為梗死心肌組織，紅色為正常心肌組織），最后對切片拍照并用Image-Pro Plus 圖像軟件對梗死面積進行定量分析。

3.4 心肌細胞凋亡 采用TUNEL 熒光染色法。常規(guī)石蠟切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇一系列浸洗后用蛋白酶k 工作液處理標本；然后加入TUNEL 反應混合液孵育60 min，滴加DAPI 染液避光孵育5 min，PBS 漂洗后封片；每個標本在熒光顯微鏡下隨機選3個不同的視野觀察TUNEL 陽性細胞（綠色熒光），TUNEL陽性細胞與細胞總數(shù)的比值為凋亡指數(shù)。

3.5 RT-qPCR 首先從心肌組織中提取RNA，然后進行逆轉錄獲取cDNA，接著進行PCR 擴增。用GAPDH 作為內參照，測定 GRP78、CHOP 和 caspase-12的mRNA 表達量。具體操作步驟嚴格按說明書進行，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.6 Western blot 首先使用RIPA 裂解液從心肌組織中提取總蛋白；然后用BCA 蛋白質濃度測定試盒定量測定蛋白濃度，用SDS-PAGE 分離蛋白并轉移到 PVDF 膜；接著分別用 cleaved caspase-3、GRP78、CHOP、caspase-12、p-PI3K、p-AKT 和 GAPDH 的Ⅰ抗稀釋液在4℃條件下過夜孵育，再用Ⅱ抗稀釋液室溫孵育2 h；最后用化學發(fā)光試劑盒顯影，用AlphaEase-FC軟件分析目標條帶的灰度值。

4 統(tǒng)計學處理

選擇SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示實驗數(shù)據(jù)。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 NAR對I/R大鼠心臟損傷的影響

1.1 心肌梗死面積 與sham 組相比，I/R 組心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05）；NAR 組梗死面積較I/R組顯著降低（P＜0.05），而NL 組梗死面積較NAR 組增加（P＜0.05），見圖1及表2。

Figure 1.Image of TTC staining of rat myocardial tissues in each group.White represents infarct area and red represents normal area.圖1 各組大鼠心肌組織TTC染色圖

表2 各組大鼠血清cTnI、心肌梗死面積和心肌細胞凋亡率的比較Table 2.Comparisons of serum cTnI，myocardial infarction area and myocardial cell apoptosis rate in each group（Mean±SD. n=6）

1.2 cTnI I/R 組血清 cTnI 濃度顯著高于 sham 組（P＜0.05）；與I/R 組相比，NAR 能顯著降低cTnI 濃度（P＜0.05）；加入 LY294002 的 NL 組 cTnI 濃度則低于NAR組（P＜0.05），見表2。

1.3 心肌組織病理變化 光鏡下可見sham 組心肌細胞排列規(guī)則、結構完整、邊界清晰，心肌纖維排列緊密，無明顯變形、水腫和炎癥細胞浸潤；I/R組心肌細胞形態(tài)結構紊亂、心肌纖維出現(xiàn)斷裂、壞死，間質中可見大量炎癥細胞浸潤；NAR 組心肌纖維排列稍疏，間質中少量炎癥細胞浸潤；NL 組心肌損傷介于I/R組與NAR組之間，見圖2。

2 NAR對心肌I/R損傷大鼠細胞凋亡的影響

TUNEL 染色結果顯示，與 sham 組相比，I/R 組可見代表凋亡細胞的綠色熒光顯著增多，心肌細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與I/R 組相比，NAR 組綠色熒光顯著減少，心肌細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與NAR 組相比，NL 組心肌細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖3及表2。

Western blot 結果顯示，I/R 組 cleaved caspase-3蛋白水平較 sham 組顯著升高（P＜0.05）；NAR 組cleaved caspase-3 蛋白水平較I/R 組降低（P＜0.05）；NL 組 cleaved caspase-3 蛋白水平較 NAR 組升高（P＜0.05），見圖4。

Figure 2.Images of HE staining of rat myocardial tissues in each group（scale bar=50 μm）.A：sham group；B：I/R group；C：NAR group；D：NL group.圖2 各組大鼠HE染色圖

Figure 3.Images of TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group (scale bar=50 μm).Green shows nuclei of TUNEL-positive cells and blue shows nuclei of total cells.圖3 各組大鼠TUNEL染色圖

3 NAR對心肌I/R損傷大鼠ERS的影響

RT-qPCR 及 Western blot 結 果 顯 示 ，I/R 組GRP78、CHOP 和 caspase-12 的 mRNA 和蛋白表達較sham 組顯著增加（P＜0.05）；NAR 組 GRP78、CHOP和 caspase-12 的 mRNA 和蛋白表達較I/R 組減少（P＜0.05）；NL 組 GRP78、CHOP 和 caspase-12 的 mRNA和蛋白表達較NAR組增加（P＜0.05），見圖5。

4 NAR 對心肌 I/R 損傷大鼠 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白水平的影響

Western blot 結果顯示，與 I/R 組相比，NAR 組 p-PI3K 和p-AKT 蛋白水平上調（P＜0.05）；與NAR 組相比，NL 組p-PI3K 和p-AKT 蛋白水平下調（P＜0.05），見圖6。

討 論

在體結扎大鼠冠脈阻斷血流是目前研究藥物對心肌I/R 損傷保護作用常用的模型之一。cTnI 僅在心肌中表達，且不受年齡、性別、心肌損傷部位等的影響，是確定心肌損傷的金標準［12］。心肌梗死面積與心肌組織病理學不僅可以反映心肌I/R 損傷的程度，還可以評價藥物治療心肌I/R 損傷的療效［13］。本實驗結果顯示，與sham 組相比，I/R 組大鼠血清cTnI和心肌梗死面積顯著增加，同時HE 染色顯示I/R 組心肌細胞形態(tài)結構紊亂，心肌纖維出現(xiàn)斷裂、壞死，表明造模成功。既往研究表明，NAR（100 mg/kg）能顯著減輕I/R 引起的心臟損傷［10］，本實驗同樣也證實NAR（100 mg/kg）能減少血清cTnI 和心肌梗死面積，減輕心肌組織病理損傷，表明NAR 對大鼠I/R 損傷心肌具有保護作用。

Figure 4.Effects of naringenin on the expression of cleaved caspase-3 and the antagonistic effect of LY294002.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；△P＜0.05 vs I/R group；#P＜0.05 vs NAR group.圖4 柚皮素對cleaved caspase-3蛋白表達的影響及LY294002的拮抗作用

Figure 6.Effects of naringenin on PI3K/AKT signaling pathway and the antagonistic effect of LY294002.Mean±SD.n=6.△P＜0.05 vs I/R group；#P＜0.05 vs NAR group.圖6 柚皮素對PI3K/AKT信號通路的影響及LY294002的拮抗作用

缺血會引起心肌細胞凋亡，再灌注則會進一步加重心肌細胞凋亡的程度，抑制細胞凋亡有助于減輕I/R 對心臟的損傷［14］。細胞凋亡的特征之一是caspases的激活，其中caspase-3是凋亡相關信號通路的集合，活化的caspase-3 可通過切割PARP 和DNAPK 等影響DNA 復制、轉錄和損傷修復，最終導致細胞凋亡的發(fā)生［15］。本實驗中，I/R顯著增加心肌細胞凋亡率和cleaved caspase-3的表達，而NAR 能降低心肌細胞凋亡率和cleaved caspase-3 的表達，提示NAR是通過抑制細胞凋亡從而發(fā)揮心臟保護作用。

細胞凋亡由多種通路調控，其中ERS 是近年來報道的一種較新的細胞凋亡調控途徑。缺血、缺氧、氧化應激和鈣超載等都能導致ERS，如果ERS 持續(xù)存在且程度嚴重就會激活相關凋亡信號通路（CHOP、caspase-12 和JNK 通路）從而啟動細胞凋亡。近來研究表明，ERS 及其介導的細胞凋亡是心肌I/R病理過程中的重要損傷因素之一，抑制ERS 有助于減輕心肌I/R損傷［13，16-17］。

GRP78 是ERS 的分子伴侶，其表達增加常常提示ERS 的發(fā)生。既往研究表明，caspase-12 是介導ERS 凋亡通路的特異性caspase 分子，ERS 發(fā)生時可激活caspase-12，活化的caspase-12 級聯(lián)效應激活caspase-9 和caspase-3，最終導致細胞凋亡的發(fā)生［18］。CHOP對ERS最為敏感，可通過調節(jié)Bcl2、TRB3等誘導細胞凋亡。Tang 等［9］的研究表明，在 H9C2 心肌細胞中，NAR 能通過調控ERS 及其介導的凋亡減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷。Yu 等［8］的研究進一步表明，在動物實驗模型中，NAR能抑制ERS改善大鼠心肌I/R 損傷。本實驗使大鼠心肌缺血30 min 再灌 注 120 min 后心肌 GRP78、CHOP、caspase-12 和cleaved caspase-3 的表達顯著增加，證實了心肌I/R損傷可引起ERS 反應并激活ERS 相關凋亡通路；予以 NAR 預處理后 GRP78、CHOP 和 caspase-12 的表達較I/R 組降低，提示NAR 能改善心肌I/R 損傷引起的ERS及其相關凋亡通路。

為進一步探討NAR 抑制心肌I/R 損傷引起的ERS 及其相關凋亡通路的作用機制，本實驗研究了PI3K/AKT 信號通路在其中的作用。PI3K/AKT 是一條具有多種生物學功能的信號通路，它的激活可以通過抑制ERS 及細胞凋亡、改善能量代謝、減輕炎癥反應及氧化應激等途徑保護心肌I/R 損傷［19］。在本實驗中，NAR 可顯著促進心肌I/R 損傷大鼠PI3K 和AKT 的活化 。 LY294002 是 PI3K/AKT 信 號 通路的特異性抑制劑。在心肌I/R 模型中，LY294002（0.3 mg/kg）能有效阻斷 PI3K/AKT 的激活［3，5］。本實驗中LY294002 也選擇該劑量，結果顯示與NAR 組相比，NL 組p-PI3K 和p-AKT 的表達降低。進一步分析顯示，抑制PI3K/AKT 信號通路后，NAR 的心臟保護作用減弱，同時其抑制ERS 及心肌細胞凋亡的作用也減弱，提示PI3K/AKT 信號通路介導了NAR 對I/R 大鼠心臟的保護作用。

綜上所述，本研究提示NAR 可能是通過激活PI3K/AKT 信號通路而調控ERS 及其相關凋亡通路，從而減輕大鼠心肌I/R損傷。