ECE1過表達通過eNOS/NO通路促進Ang Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞肥大和凋亡*

樊瓊玲， 張雪蓮， 楊 菲， 劉 濤， 趙 軍， 張石蕾， 由淑萍△

（新疆醫(yī)科大學(xué) 1護理學(xué)院，2公共衛(wèi)生學(xué)院，3新疆維吾爾自治區(qū)藥研所，新疆烏魯木齊830011）

心臟肥大（cardiac hypertrophy）是心臟長期處于壓力超負(fù)荷下的一種常見的適應(yīng)性反應(yīng)，其持續(xù)進展會導(dǎo)致心力衰竭［1-3］。研究表明，在心臟肥大的動物及細胞模型中，心肌細胞凋亡水平升高，增殖減少［3-4］。內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶 1（endothelin-converting enzyme 1，ECE1）是血管收縮肽內(nèi)皮素1（endothlin 1，ET-1）生成的限速酶，是ECE 家族的主要成員，在肺、心臟、血管內(nèi)皮組織等重要器官均有表達，主要存在于細胞質(zhì)中，對于調(diào)節(jié)ET-1 的生成和多種信號通路具有重要意義［5-6］。ET-1 與血管舒張物質(zhì)一氧化氮（nitric oxide，NO）相互協(xié)調(diào)，共同控制血管的舒縮［7-8］。本課題組前期在壓力超負(fù)荷大鼠心臟肥大模型中觀察到ECE1基因甲基化水平降低和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthesis，eNOS）通路抑制［9-10］。但ECE1 在心臟肥大發(fā)生過程中與eNOS/NO信號通路的作用及具體機制仍不清楚。本研究旨在探討過表達ECE1 對血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠H9C2 心肌細胞肥大和凋亡水平的影響及其機制。

材 料 和 方 法

1 細胞和實驗主要材料

H9C2 大鼠心肌細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。ECE-1 過表達質(zhì)粒（pEX-3-ECE1）和空載質(zhì)粒（pEX-3-NC）購自上海吉瑪有限公司；Ang Ⅱ購自APExBIO；DMEM 培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、胎牛血清、胰蛋白酶和雙抗溶液購自BI；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；4×上樣緩沖液和NO 含量檢測試劑盒購自Solarbio；彩虹蛋白Marker 和BCA 蛋白檢測試劑盒購自Thermo；FITC 偶聯(lián)的Annexin-Ⅴ凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences Pharmingen；快速質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗p-eNOS 和 β-actin 單克隆抗體購自 Bioss；兔抗 Bax 單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗Bcl-2單克隆抗體購自Proteintech?；驍U增儀和Western blot相關(guān)實驗儀器購自Bio-Rad；FluorChem E 凝膠成像儀購自ProteinSimple。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組 H9C2 心肌細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長密度至90%后以0.25% 胰酶消化，按 1∶2 或 1∶3 傳代，以含 10% 二甲基亞砜的胎牛血清凍存細胞。選取生長良好的H9C2 細胞，隨機分為空白對照（control）組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+ECE1 過表達（Ang Ⅱ+ECE1）組和 AngⅡ+陰性對照（Ang Ⅱ+NC）組。后兩組先轉(zhuǎn)染pEX-3-ECE1或pEX-3-NC后進行Ang Ⅱ刺激。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，用胰酶消化細胞，計數(shù)后接種于6 孔板中，以DMEM 培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒pEX-3-ECE1 及pEX-3-NC，與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000充分混合后，靜置20 min，于37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h后，棄去原培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

2.3 RT-qPCR 檢測 mRNA 表達水平 以 Trizol 法提取H9C2 心肌細胞的總RNA 后純化，用紫外分光光度計檢測RNA 純度，要求A260/A280＞1.8。反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，取 2 μL 產(chǎn)物進行擴增，20 μL 反應(yīng)體系，擴增條件為：95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s。實驗重復(fù) 3 次，以 2-ΔΔCt法分析ECE1、ANP 和BNP mRNA 的相對表達水平。ECE1 的上游引物序列為5′-TCATCGGCTCACTCTCCAACTCC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CCTTCTTCCACCTGTGTTCTCTGC-3′；ANP 的上游引物序列為5′-GAGAGCGGACTAGGCTGCAA-3′，下游引物序列為 5′-TCAGTGGCAAlGCGACCAA-3′；BNP 的上游引物序列為 5′-CGGATTGGCGCAGTCAGTCG-3′，下游引物序列為 5′-AGAGCCGCAGGCAGAGTCAG-3′；內(nèi)參照β-actin 的上游引物序列為5′-TGTCACCAACTGGGAGGATA-3′，下游引物序列為 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

2.4 CCK-8 法檢測細胞活力 將各組細胞接種于96 孔板，每孔5×103個細胞+100 μL 培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，37℃孵育2 h，在酶標(biāo)儀中檢測450 nm處的吸光度（A450值）。細胞活力（%）=（實驗孔A450值-空白孔A450值）/（對照孔A450值-空白孔A450值）×100%。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 PBS 清洗細胞2次后，加入胰酶消化細胞，離心后計數(shù)，將細胞接種于6孔板，每孔 5×106個，培養(yǎng) 24 h 后收集細胞；用 PBS 洗滌，加入300 μL 結(jié)合緩沖液重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC 后混勻，室溫下避光15 min；上機前5 min 加入 5 μL 碘化丙啶及 200 μL 結(jié)合緩沖液，流式細胞術(shù)分析心肌細胞的凋亡水平。

2.6 Western blot 法檢測蛋白表達水平 預(yù)冷的PBS 清洗細胞 2 次后，加入 100 μL RIPA 裂解液和 1 μL蛋白酶抑制劑（或1 μL蛋白磷酸酶抑制劑），每隔5 min 吹打一次細胞，30 min 后用細胞刮刀刮下細胞，收集細胞后以12 879×g離心20 min后，用移液器吸取上清。BCA 法測定蛋白濃度后，取30 μg 樣品，加入上樣緩沖液，在100℃下熱變性5 min，10%SDSPAGE 分離蛋白后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。將PVDF 膜加入Ⅰ抗中，4℃孵育過夜，TBST 溶液洗3次，每次5 min；加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST溶液洗3 次，每次10 min。在FluorChem E 凝膠成像儀上拍照并分析條帶灰度值，每個條帶重復(fù)測量3 次，計算目的蛋白相對表達量。

2.7 硝酸還原酶法檢測NO 含量 根據(jù)NO 含量檢測試劑盒說明書檢測H9C2 細胞培養(yǎng)液中的NO 含量。試劑混勻后，4℃靜置15 min，以對照管調(diào)零，用1 mL 玻璃比色皿測定各組波長550 nm 處的吸光度（A550值），根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NO含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后H9C2 心肌細胞中ECE1 的mRNA 及蛋白表達水平的變化

RT-qPCR 和Western blot 實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，Ang Ⅱ組ECE1的mRNA和蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過表達組ECE1 的mRNA 和蛋白表達水平進一步增加（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The expression of ECE1 in H9C2 cells after transfection.A：the mRNA expression level of ECE1；B：the protein expression level of ECE1.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖1 轉(zhuǎn)染后ECE1的mRNA及蛋白表達水平

2 過表達ECE1對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞中心臟肥大因子ANP和BNP mRNA表達的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，Ang Ⅱ組ANP和BNP的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1過表達組ANP和BNP的mRNA表達水平進一步升高（P＜0.05），見圖2。

3 過表達ECE1對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞活力影響

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AngⅡ組H9C2細胞活力顯著下降（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過表達組的細胞活力進一步下降（P＜0.05），見圖3。

Figure 2.The effect of ECE1 over-expression on the mRNA expression of cardiac hypertrophy factors ANP and BNP in Ang Ⅱ-induced H9C2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖2 過表達ECE1 對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2 心肌細胞中心臟肥大因子ANP和BNP mRNA表達的影響

Figure 3.The effect of ECE1 over-expression on the viability of Ang Ⅱ -induced H9C2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖3 過表達ECE1對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞活力的影響

4 過表達ECE1對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞凋亡水平的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AngⅡ組H9C2細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過表達組的細胞凋亡率進一步升高（P＜0.05），見圖4。

5 過表達ECE1 對凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2 表達的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，Ang Ⅱ組促凋亡蛋白Bax 表達水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平顯著下降（P＜0.05）；與AngⅡ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過表達組Bax 蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2 蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖5。

Figure 4.The effect of ECE1 over-expression on the apoptosis level of Ang Ⅱ-induced H9C2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖4 過表達ECE1對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞凋亡水平的影響

Figure 5.The effect of ECE1 over-expression on apoptosis proteins of Ang Ⅱ-induced H9C2 cells.A：the Western blot pictures of Bax and Bcl-2.B：the relative protein expressions of Bax and Bcl-2.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱgroup group.圖5 過表達ECE1對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞中凋亡蛋白Bax和Bcl-2的影響

6 過表達ECE1對eNOS蛋白及NO水平的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，各組eNOS蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05），見圖6A。與空白對照組相比，Ang Ⅱ組p-eNOS 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與 Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過表達組 peNOS 蛋白水平進一步降低（P＜0.05），見圖6A。NO含量檢測顯示，與空白對照組相比，Ang Ⅱ組的NO含量顯著降低（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過表達組的NO 含量進一步降低（P＜0.05），見圖6B。

討 論

心臟肥大是高血壓、冠心病等心血管疾病的獨立危險因素［11-12］，但其病理生理機制尚未闡明。ET-1是一種強大的血管收縮肽，已被證明是心臟肥大過程中的重要參與因子［13］。作為ET-1 生成最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，ECE1 在調(diào)節(jié)ET-1 生成與心臟肥大的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有研究證實，ECE1在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟肥大過程中表達顯著增加，ECE1下調(diào)可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟肥大［14］。在本研究中，我們觀察到過表達ECE1會顯著促進Ang Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)H9C2 心肌細胞中心臟肥大因子ANP和BNP 的mRNA 表達，并顯著降低心肌細胞活力，證明ECE1與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大有密切關(guān)系。

Figure 6.The effect of ECE1 over-expression on eNOS/NO signaling pathway.A：the protein expression levels of p-eNOS and eNOS detected by Western blot；B：the NO level.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖6 過表達ECE-1對eNOS/NO信號通路的影響

NO 與ET-1 是在血液循環(huán)中的一對血管舒張因子和收縮因子，在調(diào)節(jié)血管活動和血壓中起到了重要作用［7，15］。研究表明，ET-1 可以通過 PI3K 途徑、鈣離子依賴途徑及Rho kinase 途徑等調(diào)控eNOS/NO通路，以調(diào)節(jié) NO 的生成［16］。在肺內(nèi)皮細胞中 NO 生成的一個重要途徑是內(nèi)皮素B 型受體介導(dǎo)的eNOS的激活［17］。我們在前期動物實驗中檢測到ECE1 在壓力超負(fù)荷大鼠左室心肌組織中表達升高，且伴隨eNOS/NO 通路的激活［10］。因此，本研究通過Western blot和硝酸還原法檢測Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞中eNOS/NO信號通路的水平，并且通過ECE1過表達觀察其是否對eNOS/NO 信號通路有影響。實驗結(jié)果顯示，心肌細胞中eNOS 總蛋白水平?jīng)]有顯著差異，但p-eNOS 蛋白水平及NO 含量在Ang Ⅱ的誘導(dǎo)下顯著升高，且過表達ECE1 可進一步提高p-eNOS 蛋白水平及 NO 含量，表明 ECE1 可能通過 eNOS/NO 通路調(diào)節(jié)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞肥大。

心肌細胞凋亡水平上升和增殖受阻是多種心血管疾病的重要病理過程，壓力超負(fù)荷下的心肌細胞易發(fā)生凋亡和壞死［18］。已有研究證實，在阿霉素誘導(dǎo)的心肌病中，eNOS途徑的激活可以介導(dǎo)心肌細胞凋亡下降［19］。Hoffmann 等［20］的研究表明，eNOS敲除在內(nèi)皮細胞中顯示出顯著增強的凋亡誘導(dǎo)作用。為證實ECE1是否可以通過調(diào)控eNOS途徑而對心肌細胞的凋亡產(chǎn)生作用，我們通過流式細胞術(shù)檢測了ECE1 過表達后的凋亡水平及相關(guān)凋亡蛋白表達。實驗結(jié)果顯示，過表達ECE1后Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡率及Bax 表達水平顯著上升，而Bcl-2 表達水平顯著降低。這表明ECE1 可能通過抑制eNOS/NO信號通路調(diào)節(jié)H9C2心肌細胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示，過表達ECE1 可降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)H9C2 心肌細胞活力，促進心肌細胞肥大和凋亡，其機制可能與過表達ECE1 后eNOS/NO信號通路的抑制有關(guān)。