徐 煒, 王 劍, 宋 嘉, 陳清勇
(中國人民解放軍第903醫(yī)院,浙江杭州310013)
既往研究表明,上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為、藥物抵抗和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[1-2]。然而在經(jīng)典的腫瘤EMT及耐藥性研究方面,目前仍主要采用二維細(xì)胞培養(yǎng)(two-dimensional cell culture,2DCC)及動(dòng)物腫瘤模型。而隨著腫瘤研究的不斷深入,腫瘤微環(huán)境的重要性已備受人們關(guān)注[3],由于二維培養(yǎng)缺少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)環(huán)境,無法進(jìn)行腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的交互研究;而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期較長,并且涉及到倫理道德、個(gè)體差異、免疫排斥和種屬差異等問題,導(dǎo)致許多人類腫瘤模型無法在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制,而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最終呈現(xiàn)的是實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但實(shí)驗(yàn)的中間過程是難以被觀察的。
體外三維細(xì)胞培養(yǎng)(three-dimensional cell culture,3DCC)是介于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與二維平面細(xì)胞培養(yǎng)之間的實(shí)驗(yàn)技術(shù),該技術(shù)滿足細(xì)胞培養(yǎng)的直觀和條件可控性的基礎(chǔ)上,盡可能模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞三維形態(tài)及功能,在模擬細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)微環(huán)境相互作用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]。而體外肺癌三EMT 模型尚無文獻(xiàn)報(bào)道,本研究擬采用三維培養(yǎng)技術(shù)在體外構(gòu)建肺癌三維模型,并用轉(zhuǎn)化生長因子β1(transform growth factor-β1,TGF-β1)誘導(dǎo)形成三維EMT肺癌模型,并對(duì)其形態(tài)、蛋白表達(dá)和藥物敏感性進(jìn)行研究,揭示三維培養(yǎng)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 和順鉑抵抗的分子機(jī)制。
1.1 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系95D 購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。
1.2 主要試劑 胎牛血清和RPMI-1640 培養(yǎng)液購自 Gibco;TGF-β1 購自 PeproTech;順鉑注射液購自齊魯制藥公司;瓊脂購自Gene;氯化鈣顆粒(分析純)購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;海藻酸鈉購自Sigma;兔抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin、AKT、mTOR、p-AKT 和 p-mTOR 抗體均購自 Cell Signaling Technology;抗GAPDH 抗體購自Abcam;羊抗兔IgGⅡ抗購自杭州聯(lián)川生物有限公司;熒光羊抗兔IgGⅡ抗購自Jackson ImmunoResearch。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 95D 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素(終濃度為1×105U/L)和鏈霉素(終濃度0.1 mg/L)的 RPMI-1640 培養(yǎng)液,常規(guī)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
2.2 細(xì)胞支架制備 支架材料為瓊脂和海藻酸鈉混合物,材料終濃度為5%,外形為半徑4 mm、高度2 mm 的圓柱形米黃色干燥薄片。前期研究結(jié)果表明,該種材料的細(xì)胞支架具有無毒、生物兼容性好、降解率低、內(nèi)部孔隙率高、細(xì)胞成球快、成球率高等優(yōu)點(diǎn)[5],可用于肺癌細(xì)胞三維培養(yǎng)。
2.3 細(xì)胞接種 支架在95%乙醇中浸泡1 h 后,用無菌鑷子轉(zhuǎn)移將支架至24 孔板中,超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射2 h,室溫下晾干,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L,取40 μL 細(xì)胞懸液,輕輕添加到支架上,37℃孵育45 min之后加入1 mL培養(yǎng)液,每24 h換液一次。
2.4 EMT 模型誘導(dǎo)及細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞在支架上培養(yǎng)96 h 后基本形成細(xì)胞球,此時(shí)將培養(yǎng)液更換為含有 5 μg/L TGF-β1、0.5 μmol/L LY294002 或 10 nmol/L rapamycin 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d,每24 h換液一次。每日用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。72 h 后將支架取出,PBS 柔和漂洗3 次,4%甲醛固定24 h,梯度(50%→75%→95%→100%→100%)乙醇脫水,每次脫水15 min,室溫干燥12 h 后將樣品固定在導(dǎo)電臺(tái)上,表面噴金30 s 后在1.5 kV 電壓下用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
2.5 激光共聚焦觀察蛋白表達(dá) 棄掉培養(yǎng)液,用PBS 洗 2~3 次,每次 5 min。加 1 mL 濃度為 4% 多聚甲醛,固定細(xì)胞,室溫30 min。棄掉固定液,加PBS清洗3 次,每次5 min。棄液后加入1 mL 0.1%Triton X-100,室溫透膜 15 min。棄液后加 PBS 清洗 3 次,每次5 min。5%PBS脫脂乳封閉1 h。加Ⅰ抗,4℃孵育過夜,棄液后加PBS清洗3次,每次5 min。加熒光Ⅱ抗,避光孵育1.5 h,棄液后加PBS 清洗3 次,每次5 min。DAPI 染色 15 min,棄液后加 PBS 清洗 3 次,每次5 min。用鑷子挑起支架,用銳器輕輕刮下支架表面細(xì)胞至玻片上,蓋上蓋玻片后,再用激光共聚焦顯微鏡觀察。
2.6 MTT 法檢測(cè)三維培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性將支架均勻裁剪成4 份,95%乙醇浸泡消毒后,用無菌鑷子將支架轉(zhuǎn)移至96 孔板。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L,取10 μL 細(xì)胞懸液,輕輕添加到支架上,孵育30 min 后,加入含有 10%FBS 的培養(yǎng)液,每 24 h 換液1 次。待培養(yǎng)96 h 后,三維培養(yǎng)EMT 組更換為含有5 μg/L TGF-β1 的培養(yǎng)液和順鉑濃度分別為0、2、4、8、16和32 μmol/L 的培養(yǎng)液;三維培養(yǎng)組加入順鉑濃度分別為0、2、4、8、16和32 μmol/L的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)3 d,每24 h 換液1 次。兩組均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔,待培養(yǎng)結(jié)束后,于各孔加人20 μL MTT 溶液(5 g/L,無菌PBS配制),37℃溫箱孵育4 h,棄培養(yǎng)液,各孔加入150 μL 二甲基亞砜,搖床避光輕搖10 min,96 孔板離心機(jī)低速離心(200×g,5 min),分離支架與上清液,每孔吸100 μL 上清液置于另一96 孔板內(nèi),酶標(biāo)儀在490 nm 處檢測(cè)A值,繪制細(xì)胞活力抑制率曲線,其中橫坐標(biāo)為藥物濃度(μmol/L),縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力抑制率(%)。
2.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并加入裂解液充分裂解,低溫高速離心(4℃,13 800×g,15 min),提取上清-80℃保存。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度,煮沸變性后每個(gè)泳道加入總蛋白10 μg,8% SDSPAGE 分離后,轉(zhuǎn)印(300 mA,120 min)到 PVDF 膜上。5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉1 h。洗膜后加入Ⅰ抗,4℃孵育過夜。Ⅱ抗(1∶3 000)孵育1.5 h 后洗膜,加入ECL 發(fā)光液,凝膠成像系統(tǒng)照相,用ImageJ軟件分析條帶灰度值。
以上實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次。應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA),兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
倒置熒光顯微鏡結(jié)果顯示,三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞呈聚集生長,細(xì)胞無偽足,細(xì)胞球表面較為光滑,細(xì)胞球之間存在明顯的界限;當(dāng)加入TGF-β1 后,原本表面緊實(shí)的細(xì)胞球出現(xiàn)了細(xì)胞離散、遷移,見圖1。
掃描電鏡結(jié)果顯示,三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞呈球形生長,細(xì)胞球表明圓滑,而在TGF-β1 刺激后,細(xì)胞球出現(xiàn)了塌陷,細(xì)胞間的黏附不再緊密,底部細(xì)胞有細(xì)小偽足出現(xiàn),細(xì)胞向周圍遷移,見圖2。
激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,TGF-β1刺激后E-cadherin 蛋白表達(dá)無明顯變化,而N-cadherin 和vimentin蛋白表達(dá)上調(diào),見圖3。
Western blot 顯示,TGF-β1 刺激后 E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01),而N-cadherin 和vimentin 蛋白表達(dá)上調(diào)(均P<0.01),見圖4。
Figure 1.The effect of TGF-β1 on the morphological changes of three-dimensionally cultured 95D cells observed by inversed fluorescence microscopy(scale bar=200 μm).A:control group;B:TGF-β1 group.圖1 倒置熒光顯微鏡觀察TGF-β1 對(duì)三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞形態(tài)的影響
Figure 3.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells observed by laser confocal microscopy(scale bar=100 μm).A,D:E-cadherin;B,E:N-cadherin;C,F(xiàn):vimentin.A~C:control group;D~F:TGF-β1 group.圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察TGF-β1 對(duì)三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響
熒光倒置顯微鏡觀察顯示,PI3K 抑制劑LY294002 及 mTOR 抑制 劑 rapamycin 可顯 著 抑制TGF-β1刺激后細(xì)胞球的離散和遷移,見圖5。
Figure 4.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells detected by Western blot.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control group.圖4 Western blot檢測(cè)TGF-β1對(duì)三維培養(yǎng)95D細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響
Figure5.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced mesenchymal phenotype of three-dimensionally cultured 95D cells.A:control group;B:TGF-β1 group;C:TGF-β1+LY294002 group;D:TGF-β1+rapamycin group.Scale bar=200 μm.圖5 LY294002和rapamycin逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)三維培養(yǎng)95D細(xì)胞的間充質(zhì)表型
Western blot 結(jié)果顯示,與 control 組比較,TGF-β1 處理三維培養(yǎng)95D細(xì)胞可誘導(dǎo)AKT和mTOR磷酸化水平升高(P<0.05),同時(shí)E-cadherin 表達(dá)下調(diào)(P<0.05),N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)(P<0.01);與TGF-β1 組比較,LY294002 可抑制 AKT 和 mTOR 磷酸化(P<0.05),上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)(P<0.05),下調(diào) N-cadherin 和 vimentin 表達(dá)(P<0.01);與 TGF-β1 組比較,rapamycin 不能抑制 AKT 磷酸化(P>0.05),但可抑制 mTOR 磷酸化(P<0.01),上調(diào) E-cadherin 蛋白表達(dá)(P<0.05),下調(diào) N-cadherin 和 vimentin表達(dá)(P<0.01),見圖6。
MTT 結(jié)果表明,TGF-β1 可增強(qiáng)三維培養(yǎng) 95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗,而LY294002 和rapamycin 可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象;計(jì)算 IC50值顯示,與 TGF-β1 組[(8.42±0.61)μmol/L]相比,空白組[(6.12±0.54)μmol/L]、LY294002 組[(6.34±0.28)μmol/L]和 rapamycin 組[(6.56±0.03)μmol/L]95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性均較高(P<0.01),見圖7。
肺癌已成為死亡率最高的腫瘤,轉(zhuǎn)移和耐藥是肺癌治療失敗的重要原因之一,而EMT 與此密切相關(guān)[6]。目前關(guān)于EMT 的研究基本停留在二維細(xì)胞培養(yǎng)模型層面,與二維模型相比,三維培養(yǎng)可以更好地模擬腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成,提供更準(zhǔn)確的擴(kuò)散率和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征[7]。從本質(zhì)上講,三維培養(yǎng)具有與體內(nèi)相似的腫瘤條件。例如,它們表現(xiàn)出缺氧區(qū)、靜止區(qū)(干細(xì)胞樣)和增殖細(xì)胞區(qū)、電化學(xué)梯度以及細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-微環(huán)境相互作用,這與實(shí)體腫瘤微環(huán)境相似[8]。
三維培養(yǎng)條件下EMT發(fā)生時(shí)細(xì)胞形態(tài)是與二維培養(yǎng)不同。EMT 發(fā)生后,細(xì)胞球可長出鹿角樣和樹枝樣的“觸角”,這些“觸角”是由多個(gè)細(xì)胞構(gòu)成管狀三維結(jié)構(gòu),可向周圍侵襲生長[9]。在蛋白表達(dá)方面雖也表現(xiàn)為E-cadherin 下調(diào),vimentin 和N-cadherin等蛋白上調(diào),但與二維培養(yǎng)條件下發(fā)生的EMT相比,同種細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件下發(fā)生EMT時(shí)表現(xiàn)出偏向于上皮形態(tài),即更高的E-cadherin 和更低的vimentin表達(dá),并且具有類似腫瘤干細(xì)胞的特性,這種特性是二維培養(yǎng)細(xì)胞不具備的[10]。
Figure 6.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transformation and activation of PI3K/AKT/mTOR pathway in three-dimensionally cultured 95D cells.Mean±SD. n=4.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TGF-β1 group.圖6 LY294002和rapamycin逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的三維培養(yǎng)95D細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及PI3K/AKT/mTOR 通路活化
三維培養(yǎng)條件下構(gòu)建EMT 模型的報(bào)道極少,主要受培養(yǎng)方法、生物材料和細(xì)胞本身對(duì)三維環(huán)境及誘導(dǎo)因子敏感性等因素的影響,因此構(gòu)建EMT 模型較難。例如Pal 等[11]觀察不同生物材料對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT 的誘導(dǎo)作用,結(jié)果顯示細(xì)胞接種在聚乳酸-乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]和明膠甲基丙烯酰胺(gelatin methacrylamide,GelMA)混合材料支架后,相比單用這兩種材料更易誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。Essid等[12]采用無血清懸浮培養(yǎng)方法獲得腫瘤細(xì)胞球,再用EGF 和FGF 等細(xì)胞因子和低氧條件誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT,而常氧和正常血清條件可逆轉(zhuǎn)EMT 過程。然而上述實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建EMT模型耗時(shí)較長,需3~14 d,過程也較為繁瑣,此外上述研究多集中在細(xì)胞表型、蛋白表達(dá),對(duì)功能及相關(guān)信號(hào)通路的研究較少。本研究期望采用一種快速、簡便的方法構(gòu)建體外肺癌三維EMT 模型,并對(duì)其表型、蛋白表達(dá)以及功能、信號(hào)通路進(jìn)行研究。我們前期在3D 打印支架上培養(yǎng)肺癌95D 細(xì)胞可快速構(gòu)建體外肺癌三維模型[5],可在該研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索EMT及藥敏的分子機(jī)制。
Figure 7.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced resistance to cisplatin in three-dimensionally cultured 95D cells.A:the cell viability was detected by MTT assay;B:the IC50 values of each group.Mean±SD. n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TGF-β1 group.圖7 LY294002和rapamycin逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的三維培養(yǎng)肺癌95D細(xì)胞順鉑抗性
我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明,95D 細(xì)胞在二維培養(yǎng)條件下,對(duì)TGF-β1 刺激無反應(yīng),但在三維培養(yǎng)條件下有明顯反應(yīng),12 h 即可觀察到細(xì)胞球離散現(xiàn)象,這表明三維環(huán)境可改變細(xì)胞的生物學(xué)行為。在加入TGF-β1 刺激 3 d 后,三維培養(yǎng) 95D 細(xì)胞球出現(xiàn)了明顯的塌陷,細(xì)胞球中的細(xì)胞發(fā)生離散、遷移。電鏡檢測(cè),加入TGF-β1 刺激后,細(xì)胞球底部的細(xì)胞生長出偽足,并向周圍遷移。進(jìn)一步用Western blot 驗(yàn)證顯示,TGF-β1 刺激后的三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞出現(xiàn)了E-cadherin 下調(diào),N-cadherin 和 vimentin 上調(diào),表明確實(shí)發(fā)生了EMT,與激光共聚焦觀察到的結(jié)果基本一致。
既往研究表明,PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與腫瘤EMT 及耐藥密切相關(guān)[13],但在三維培養(yǎng)條件下是否有影響需進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,EMT組的p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,而加入PI3K及mTOR抑制劑后,p-AKT、pmTOR 蛋白表達(dá)較EMT明顯下降,并且EMT被逆轉(zhuǎn),表現(xiàn)為 E-cadherin 上調(diào),N-cadherin 和 vimentin 下調(diào),細(xì)胞球未出現(xiàn)細(xì)胞離散現(xiàn)象。這表明TGF-β1 誘導(dǎo)三維培養(yǎng)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 可能是通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。MTT 結(jié)果顯示,發(fā)生EMT 的三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著低于對(duì)照組,而加入PI3K及mTOR抑制劑后,可重新增強(qiáng)三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,進(jìn)一步凸顯了PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在三維培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)藥物抵抗機(jī)制中的作用。
綜上所述,本研究在3D 打印技術(shù)構(gòu)建體外肺癌三維模型基礎(chǔ)上利用TGF-β1 成功將其誘導(dǎo)為EMT模型,該方法具有簡單、快速成型、條件可控等特點(diǎn),并且發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT及對(duì)順鉑抵抗可能是通過PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。這一新型的體外腫瘤模型可為腫瘤轉(zhuǎn)移和藥敏研究提供有力工具。