基于Nrf2通路探討阿里紅三萜酸減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用*

古麗尼歌爾·阿布都米吉提， 沙依拜·沙比提， 叢媛媛， 帕麗達(dá)·阿不力孜

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830011）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）以彌漫性肺泡肺間質(zhì)水腫，難治性低氧血癥及非心源性肺水腫為特征［1-2］，與體內(nèi)氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）及炎癥介質(zhì)升高具有關(guān)聯(lián)性［3］。氧化應(yīng)激在體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），可引起氣道和血管重塑、侵襲肺間質(zhì)導(dǎo)致肺水腫、對(duì)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞造成氧化損傷等［4］。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激損傷主要建立在ALI 的發(fā)生發(fā)展過程中［5］。轉(zhuǎn)錄因子核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）信號(hào)通路是一條保護(hù)性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，保護(hù)機(jī)體抵抗外界氧化應(yīng)激反應(yīng)［6］。未受刺激時(shí)，Nrf2與Kelch 樣環(huán)氧氯丙胺相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1，Keap1）存在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)Nrf2受到氧化應(yīng)激時(shí)則與Keap1解離，Nrf2立即進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游基因如抗氧化酶及Ⅱ相激酶的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而表達(dá)一系列相關(guān)蛋白如血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用［7］。

阿里紅為多孔菌科層孔菌屬植物苦白蹄的子實(shí)體，具有止咳平喘、祛風(fēng)利濕、消腫止痛的功效，民間常用于治療肺炎、慢性支氣管炎等疾病［8］。研究顯示，阿里紅的主成分之一三萜酸具有抗炎和抗氧化等藥理作用［9］，但其是否對(duì)ALI具有保護(hù)作用鮮少見到報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型，探討FOTa對(duì)ALI的作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

60 只 SPF 級(jí)雄性昆明小鼠，6～8 周齡，體重為（20±2）g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（新）2018-0003，小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境，在室溫（20～25℃）和濕度40%～60%的環(huán)境下自由攝食飲水。

2 主要試劑

阿里紅藥材購(gòu)于自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天藥/生藥教研室帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為阿里紅（Fomes OfficinalsAmes）。地塞米松（dexamethasone，Dex）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖（lipopolysoccharide，LPS）購(gòu)自sigma；小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；血?dú)馄?gòu)自IDEXX；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；TaKaRa試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；兔源Keap1、兔源Nrf2 和兔源HO-1 抗體購(gòu)自Abcam；兔源β-actin購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Keap1、Nrf2、HO-1 和β-actin 所用引物由上海生物工程有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3 主要方法

3.1 FOTa 的提取及含量測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］精密稱定阿里紅生藥材粗粉（30 目）約220 g，置圓底燒瓶中，加入95%乙醇2.2 L，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，即得。采用紫外-分光光度法進(jìn)行FOTa 的含量測(cè)定，即Y＝32.848X+0.0496，R＝0.9992，含量為33.5%，得率為15.9%。給藥前，按照阿里紅藥材成人給藥劑量［11］與折算系數(shù) W 計(jì)算出 70 mg/kg、140 mg/kg 和280 mg/kg 3 個(gè)劑量，用氯化鈉注射液各配成相應(yīng)濃度的溶液。

3.2 動(dòng)物分組及處理 將60 只雄性昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為6 組：對(duì)照（control）組、模型［12］組（LPS 5 mg/kg 組）、地塞米松［12］組（Dex 1 mg/kg 組）及FOTa 70 mg/kg、140 mg/kg和280 mg/kg 組，每組10只。FOTa 干預(yù)組連續(xù)灌胃相應(yīng)濃度FOTa 4 周，其余組灌胃同等體積生理鹽水，末次灌胃生理鹽水后，Dex 組腹腔注射1 mg/kg，30 min后除對(duì)照組外，其余各組腹腔注射5 mg/kg LPS 進(jìn)行造模。造模成功條件以處理動(dòng)物當(dāng)天PaO2/FiO2值與造模前后體重變化值來確定，即 PaO2：FiO2＜300 mmHg 與造模后體重驟降作為成功標(biāo)志。造模后10 h，取血，脫頸處死小鼠，取左下肺葉檢測(cè)肺濕/干重比值（wet/dry weight ratio，W/D），取左上肺葉放于4%多聚甲醛中固定用于病理切片，取右肺組織放置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 小鼠血氧分壓、二氧化碳分壓及氧合指數(shù)分析 小鼠模型建立10 h 后，取小鼠腹主動(dòng)脈血液標(biāo)本行血?dú)夥治觯?］。

3.4 肺組織W/D 檢測(cè) 用濾紙輕輕吸干肺組織表面水分并置于稱量瓶中精密稱取濕重，在80 ℃干燥箱內(nèi)烘烤48 h，精密稱取干肺重量并按照C=W濕/W干計(jì)算肺組織的濕干重比。

3.5 試劑盒檢測(cè)血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD和GSH-Px 含量 取血，在4 ℃，1006 ×g的條件下分離血清，按照ELISA 方法，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，采用說明書進(jìn)行規(guī)范加樣，最后選擇450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)A值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值及相應(yīng)的濃度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度值。

3.6 HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化 將肺組織置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切成約5 μm 厚的薄片之后用二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫水置換。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，清洗、脫水、封片，于400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。分別以肺泡水腫、肺泡內(nèi)充血、肺泡內(nèi)充血、肺間質(zhì)水腫程度評(píng)分：無改變或非常輕微為0 分，輕度改變?yōu)? 分，中度改變?yōu)? 分，重度改變?yōu)? 分，極重度改變?yōu)? 分，累計(jì)上述4 項(xiàng)的平均分值即為肺損傷評(píng)分［13］。

3.7 RT-qPCR 檢測(cè)肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1 的mRNA 表達(dá)量 肺組織用Trizol 法提取總RNA，按照試劑盒操作說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40 個(gè)循環(huán)。用目的基因的Ct 值減去內(nèi)參照的Ct 值，得出ΔCt 值，然后用待測(cè)組分的ΔCt 值減去正常組的ΔCt值，得出 ΔΔCt 值，采用 2-ΔΔCt分析方法分析目的基因表達(dá)量。

3.8 Western blot 檢測(cè)肺組織中 Nrf2、Keap1 及 HO-1的蛋白表達(dá)量 取50～100 mg 肺組織在液氮中進(jìn)行研磨，并立刻放入RIPA 緩沖液中，待組織與緩沖液充分反應(yīng)后，離心取上清，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，每孔等量加樣，依次進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液封閉，洗膜并依次加入到Keap1、Nrf2、HO-1（1：1000）和β-actin Ⅰ抗（1∶5 000），4℃孵育過夜。次日洗膜，加入Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育60 min，洗膜，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)試劑盒顯影。用ImageJ圖像分析方法進(jìn)行灰度值分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析結(jié)合多組間方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FOTa 對(duì)ALI 小鼠血氧分壓、二氧化碳分壓及氧合指數(shù)影響

與對(duì)照組相比，模型組PaO2與PaO2/FiO2降低（P ＜0.05），PaCO2升高（P ＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)OTa-280 mg/kg 組 及 Dex 組 PaO2與 PaO2/FiO2升 高（P ＜0.05），PaCO2降低（P ＜0.05），見圖1。

2 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織W/D的影響

與對(duì)照組相比，模型組的W/D 升高（P ＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)OTa-280 mg/kg組及Dex組的W/D降低（P ＜0.05），見圖2。

3 FOTa 對(duì)小鼠血清中 MDA、SOD 和 GSH-Px 水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的MDA 水平升高（P ＜0.05），SOD 及 GSH-Px 水平降低（P ＜0.05）；與模型組比較，F(xiàn)OTa 280 mg/kg 組及Dex 組均能降低血清中 MDA 水平（P＜0.05），升高 SOD 及GSH-Px 水平（P＜0.05），見圖3。

4 FOTa對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)的影響

結(jié)果顯示，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯異常；模型組肺泡腔和間質(zhì)可見大量紅細(xì)胞滲出，并伴有肺間質(zhì)水腫、肺泡結(jié)構(gòu)被破壞、肉眼見片狀血灶；FOTa-280 mg/kg組及Dex組肺組織紅細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺泡結(jié)構(gòu)有所改善，肺間質(zhì)水腫減輕，片狀血灶明顯減少，與對(duì)照組相比，模型組肺組織損傷評(píng)分升高（P＜0.05）。與模型組相比，F(xiàn)OTa-280 mg/kg 組及Dex 組肺組織損傷評(píng)分降低（P＜0.05），見圖4、5。

Figure 1.The effect of FOTa on indexes of arterial blood gas analysis in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 FOTa對(duì)ALI小鼠動(dòng)脈血中血?dú)夥治鱿嚓P(guān)指標(biāo)的影響

Figure 2.The effect of FOTa on the wet-to-dry weight ratio（W/D）of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織濕干重比例的影響

5 FOTa 對(duì) ALI 小鼠肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1 mRNA表達(dá)量的影響

與對(duì)照組相比，模型組Keap1 mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05），Nrf2 與 HO-1 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)OTa-280 mg/kg 組及Dex組 Keap1 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.01），Nrf2 與HO-1 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 3.The effect of FOTa on the oxidative stress（serum MDA，SOD and GSH-Px levels）in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 FOTa對(duì)ALI小鼠血清中氧化應(yīng)激水平的影響

Figure 4.Effect of FOTa on the histopathological changes of the lung tissue in ALI mice（HE staining，scale bar=50 μm）.圖4 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響

Figure 5.Effect of FOTa on the lung injury score of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織損傷評(píng)分的影響

6 FOTa 對(duì) ALI 小鼠肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組Keap1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），Nrf2 與HO-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)OTa 低、中、高劑量組及Dex組 Keap1 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），Nrf2 和HO-1蛋白水平升高（P＜0.05），見圖7。

討 論

ALI 以發(fā)病機(jī)制繁瑣，病情進(jìn)展迅猛為特點(diǎn)，被稱為臨床常見的危急重疾病之一［14］。研究顯示，革蘭陰性細(xì)菌感染引發(fā)膿毒癥是ALI 的主要原因［15］，也因此而引發(fā)肺部炎癥細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)［16］。外膜是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要致病因素，而脂多糖正是存在于外膜的內(nèi)毒素主成分［17］，它在很大程度上可以模擬膿毒癥和ALI。在動(dòng)物模型中，因?yàn)闅夤茏⑸淇赡馨橛袊?yán)重出血和壞死的可能性，因此通過腹腔注射以誘發(fā) ALI［18］。

Figure 6.Effects of FOTa on the mRNA expression of Keap1，Nrf2 and HO-1 in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖6 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織Keap1，Nrf2及HO-1 mRNA表達(dá)的影響

Figure 7.Effect of FOTa on the Keap1，Nrf2 and HO-1 protein expression in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖7 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織中Keap1、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)中，W/D 升高及病理切片中大量紅細(xì)胞滲出、片狀血灶，可視為L(zhǎng)PS 成功誘發(fā)了炎癥反應(yīng)。根據(jù)柏林定義［2］，將 PaO2：FiO2＜300 mmHg 稱作為ALI。本實(shí)驗(yàn)血?dú)庵笜?biāo)顯示，模型組小鼠PaO2：FiO2＜300 mmHg（PaO2/FiO2≈250，F(xiàn)iO2=0.21），PaCO2升高。而動(dòng)脈血中PaCO2的升高嚴(yán)重影響了機(jī)體的換氣功能。綜合上述結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)建立模型成功。給藥組中，PaCO2明顯降低說明機(jī)體換氣功能有所改善。FOTa 對(duì)PaCO2的升高有了明顯緩解作用，這可能是FOTa 抑制了肺部炎癥反應(yīng)，提高了血氧結(jié)合比，從而改善了肺部功能。

在LPS 誘導(dǎo)下，炎癥細(xì)胞可通過浸潤(rùn)肺組織引發(fā)炎癥因子聚集而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)［19］，外源性和內(nèi)源性ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是引發(fā)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞損傷的重要因素［20］，其中，SOD 與 GSH-Px 兩種酶在肺組織內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中起重要作用，而MDA 作為自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，反映肺組織的損傷程度［21］。ELISA 法顯示，模型組血清中 SOD與GSH-Px 濃度降低，此結(jié)果可能與LPS 引發(fā)的肺部氧化應(yīng)激有關(guān)，而MDA 濃度升高也證明了這一結(jié)果。FOTa 的應(yīng)用降低了MDA，升高了SOD 與GSHPx 的水平，從而阻止了氧化應(yīng)激對(duì)正常肺組織細(xì)胞的損傷，降低了肺組織炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)。

Nrf2 介導(dǎo)的信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)維持氧化應(yīng)激的重要信號(hào)通路。此外，研究表明Keap1 是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵傳感器［22］。經(jīng)LPS刺激，模型組中Keap1蛋白表達(dá)水平升高，此結(jié)果表明Keap1 參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘發(fā)。接著，在氧化脅迫下Nrf2 從Keap1 中釋放出來，從而激活其在核中下游調(diào)控的基因—HO-1［23］。研究顯示，HO-1 具有較強(qiáng)的抗炎作用［24］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)FOTa 增加HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平的結(jié)果推測(cè)FOTa 與HO-1 共同協(xié)調(diào)了抗炎作用。而Nrf2 通過調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白的功能來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［24］。研究顯示，Nrf2 未激活時(shí)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平極高，也是ALI 發(fā)展迅猛的時(shí)期［25］。給藥組中FOTa 升高了Nrf2 的蛋白表達(dá)水平，表明當(dāng)藥物發(fā)揮保護(hù)作用時(shí)，Nrf2 是以激活的狀態(tài)存在體內(nèi)的。綜上所述，Nrf2 信號(hào)通路參與了FOTa 減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的病理生理過程。