RIP3/CaMKII信號(hào)通路對(duì)重癥病毒性心肌炎小鼠心臟功能及生存曲線的影響*

周 飛， 滕 林， 鄒文博， 楊 俊， 丁家望， 李 松

（三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北宜昌443003）

炎癥刺激因子（如腫瘤壞死因子α）觸發(fā)的程序性壞死（necroptosis）是一種由死亡受體和配基啟動(dòng)、依賴于受體相互作用蛋白（receptor-interacting proteins，RIPs）活化介導(dǎo)的可調(diào)控性細(xì)胞壞死。RIPs 作為重要的信號(hào)分子啟動(dòng)和調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，決定細(xì)胞走向凋亡、壞死或存活等不同命運(yùn)，有2 個(gè)RIPs即RIP1 和RIP3 在程序性壞死通路中起到關(guān)鍵作用［1］。新近的證據(jù)表明，可以調(diào)控的程序性壞死在心肌細(xì)胞壞死的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中，包括RIP1-RIP3-混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domainlike protein，MLKL）通路和RIP3-鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）-線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）通路等，然而其潛在的機(jī)制并未完全明確［2］。

病毒性心肌炎主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞變性壞死和氧化應(yīng)激引起的一系列事件的發(fā)生，心肌細(xì)胞幾乎沒有修復(fù)、再生及增殖能力，心肌細(xì)胞的進(jìn)行性壞死及心臟收縮或舒張功能障礙是影響其預(yù)后的重要因素。既往的研究認(rèn)為心肌細(xì)胞的壞死是不可調(diào)控且被動(dòng)的過程，我們的研究表明可以調(diào)控的程序性壞死是病毒性心肌炎心肌細(xì)胞壞死的主要方式，RIP1/RIP3壞死體介導(dǎo)的程序性壞死在病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［3］。有研究表明，RIP3 在缺血再灌注心肌損傷模型中起到關(guān)鍵作用，通過介導(dǎo)CaMKII 磷酸化和抑制活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）而減少心肌細(xì)胞程序性壞死，并且不依賴于 RIP1-RIP3-MLKL 通路［4］。本研究擬通過構(gòu)建柯薩奇病毒B3（Coxsaekie virus B3，CVB3）誘導(dǎo)的急性重癥病毒性心肌炎小鼠模型，從整體水平探討RIP3/CaMKII 介導(dǎo)心肌細(xì)胞程序性壞死在重癥病毒性心肌炎中的作用，以期為病毒性心肌炎的防治提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

母乳喂養(yǎng)至4 周齡的SPF 級(jí)純種近交系雄性BALB/c 小鼠由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（鄂）2008-0004，體重16～20 g。

2 主要試劑

嗜心性CVB3 Nancy 株系美國引進(jìn)，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物研究所惠贈(zèng)；抗CaMKII 抗體購自Cell Signaling Technology；CaMKII 的特異性抑制劑KN-93 購自Merck；ROS 的特異性抑制劑鈦劑（titanium，Ti）購自Sigma；過氧化氫檢測(cè)試劑盒購自Abcam；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

3 主要方法

3.1 CVB3 型心肌炎BALB/c 小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組［5］取6 周齡雄性 BALB/c 小鼠，模型組腹腔內(nèi)無菌接種1 000 倍半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50%tissue culture infectious dose，TCID50）的CVB3（0.2 mL）制作急性重癥病毒性心肌炎動(dòng)物模型；正常對(duì)照組每只小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 mL；藥物治療組每只小鼠除腹腔注射CVB3（0.2 mL）外，4 h 后尾靜脈注射不同的藥物［KN-93（10 μmol/kg）和Ti（20 μmol/kg），均溶于0.1% DMSO］；藥物對(duì)照組每只小鼠除腹腔注射CVB3（0.2 mL）外，根據(jù)不同藥物劑量注射等劑量的0.1%DMSO；空白對(duì)照組小鼠無任何處理。以上小鼠腹腔及靜脈注射藥物治療連續(xù)7 d。于第7 天檢測(cè)小鼠血清心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）水平；第1、2 和4 周采用心臟超聲技術(shù)評(píng)估心臟功能并測(cè)定30 d生存率。

3.2 心臟超聲技術(shù)對(duì)心功能的測(cè)定 采用心臟超聲技術(shù)測(cè)定左室心功能，即左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、左室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）和左室收縮期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at systole，LVIDs），以評(píng)估重癥病毒性心肌炎的誘導(dǎo)及其程度。

3.3 心肌組織壞死性標(biāo)志物的檢測(cè) 血清cTnI 水平分析在三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科檢測(cè)完成，具體操作根據(jù)試劑盒說明。

3.4 CaMKII 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測(cè) 用蛋白裂解液及PMSF 裂解細(xì)胞低溫離心后取上清，取20 μg蛋白樣品，進(jìn)行10%SDS-PAGE，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1 h；I 抗4℃過夜。將膜與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgG 抗體孵育，室溫輕搖1 h，用圖像分析軟件測(cè)定各條帶吸光度（A）以進(jìn)行定量分析。

3.5 心肌組織過氧化氫含量的檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)小鼠處死后立即取約0.1 g 心肌組織，分別經(jīng)液氮速凍后，于4℃破碎、加入預(yù)冷的PBS 研磨制備成為組織勻漿，然后以BCA 法測(cè)定總蛋白含量。實(shí)驗(yàn)前按試劑盒說明書建立過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線，取各組心肌組織勻漿（總蛋白3 μg），分別加入過氧化氫檢測(cè)稀釋液后，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)A值并以標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行過氧化氫濃度的確定。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)（Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)）和方差齊性檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CaMKII 抑制劑KN-93 顯著改善重癥病毒性心肌炎小鼠心臟功能和生存曲線

與正常對(duì)照組相比，病毒感染第7 天，CVB3 組小鼠血清cTnI 水平顯著顯升高（P＜0.01），提示心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重，見圖1A。CVB3 組小鼠存活率40%左右，提示模型為重癥病毒性心肌炎，見圖1E。加入KN-93 后，CaMKII 蛋白水平顯著下降（P＜0.01），提示KN-93 對(duì)CaMKII 有顯著的抑制作用，見圖1F。病毒感染第 7 天，與 CVB3 組相比，CVB3+KN-93 組小鼠血清cTnI 水平顯著下降（P＜0.01），提示KN-93 有顯著的心肌保護(hù)作用，見圖1A。第1、2 和4 周小鼠心臟超聲檢查提示，無論是EF、FS 還是LVIDs，CVB3+KN-93 組較CVB3 組均顯著好轉(zhuǎn)（P＜0.01）；其30 d的生存曲線也明顯改善（P＜0.01），見圖1B～E。

Figure 1.Protective effect of KN-93 on mice with severe viral myocarditis.A：the serum level of cardiac troponin I（cTnI）in each group；B～D：ejection fraction（EF），fractional shortening（FS）and left ventricular internal diameter at systole（LVIDs）in each group at 1，2 and 4 weeks（W）；E：Kaplan-Meier survival curves of each group；F：the protein expression of CaMKII detected by Western blot.Mean±SD. n=5. **P＜0.05 vs normal（N）group；＃P＜0.05 vs CVB3 group.圖1 KN-93對(duì)重癥病毒性心肌炎小鼠的保護(hù)作用

2 ROS 抑制劑Ti 對(duì)重癥病毒性心肌炎小鼠心臟功能和生存曲線的影響

CVB3+KN-93 組小鼠心肌組織過氧化氫含量較CVB3 組顯著下降（P＜0.01）；加入ROS 抑制劑Ti 后，CVB3+KN-93+Ti 組過氧化氫含量較CVB3+KN-93 組輕度下降（P＜0.05），見圖2A。CVB3+KN-93+Ti 組與CVB3+KN-93 組血清 cTnI 水平無顯著差異（P＞0.05），見圖2B。CVB3+KN-93+Ti 組較CVB3+KN-93組的心臟功能和生存曲線均無明顯改善（P＞0.05），見圖2C～F。

Figure 2.Protective effect of Ti on mice with severe viral myocarditis.A：the content of H2O2 was measured in each group；B：the serum level of cardiac troponin I（cTnI）in each group；C～E：ejection fraction（EF），fractional shortening（FS）and left ventricular internal diameter at systole（LVIDs）in each group at 2 and 4 weeks（W）；F：Kaplan-Meier survival curves of each group.Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs CVB3 group；▲P＜0.05 vs CVB3+KN-93 group.圖2 鈦劑對(duì)重癥病毒性心肌炎小鼠的保護(hù)作用

討 論

程序性壞死作為一種新的細(xì)胞程序性死亡方式，在許多疾病的病理生理過程中發(fā)揮了重要作用，特別在急性炎癥、缺血性損傷及病毒感染等急重癥疾病中［6］。眾所周知，病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制主要是反復(fù)的病毒感染導(dǎo)致對(duì)心肌細(xì)胞的持續(xù)損害及其誘發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)。胱天蛋白酶（caspase）是啟動(dòng)凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白，病理狀態(tài)下ATP 不足以維持caspase 的功能，導(dǎo)致凋亡通路出現(xiàn)障礙，細(xì)胞很容易出現(xiàn)程序性壞死［7-8］。我們前期的研究表明，程序性壞死是病毒性心肌炎心肌細(xì)胞死亡的主要方式［9］。程序性壞死可以被多種途徑所啟動(dòng)，RIP3 通過介導(dǎo)CaMKII 磷酸化導(dǎo)致mPTP 開放，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，引起鈣超載，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的程序性壞死；CaMKII 的特異性抑制劑KN-93 有明顯的心肌保護(hù)作用且安全可靠［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用CaMKII 的特異性抑制劑KN-93 后，CaMKII 的蛋白水平顯著下降，表明心肌細(xì)胞的程序性壞死受到顯著抑制；并且這種抑制明顯減少心肌細(xì)胞的壞死，我們通過1～4周的連續(xù)心臟超聲觀察到心肌細(xì)胞壞死的減少直接導(dǎo)致小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能明顯改善；這些改善最終導(dǎo)致其30 d 生存率明顯提高。因此，這些數(shù)據(jù)表明在重癥病毒性心肌炎模型中RIP3 通過CaMKII 介導(dǎo)的程序性壞死起著重要作用，但潛在的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

眾所周知，氧化應(yīng)激在細(xì)胞壞死的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，涉及到壞死的各個(gè)環(huán)節(jié)［11］。已有研究表明，RIP3 不僅通過CaMKII 介導(dǎo)的磷酸化和自身磷酸化過程介導(dǎo)程序性壞死，CaMKII 還能通過激活ROS 的發(fā)生而導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死［4］。本研究發(fā)現(xiàn)加入 ROS 抑制劑 Ti 后，KN-93 組 H2O2水平雖有一定程度的下降，但并未明顯較少心肌細(xì)胞的壞死，也沒有改善小鼠的心臟功能和30 d生存曲線。這些數(shù)據(jù)表明加入Ti后ROS的輕度下降并沒有帶來預(yù)后的改善。但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，即使沒有Ti 的抑制，CVB3+KN-93 組較 CVB3 組 H2O2水平明顯下降，提示KN-93 通過特異性抑制CaMKII 本身就能明顯減少ROS 的產(chǎn)生，這說明本模型中小鼠的ROS 可能已被KN-93 大部分抑制。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)從正反兩方面證實(shí)KN-93 除特異性抑制CaMKII 阻斷RIP3 介導(dǎo)的程序化壞死外，還通過抑制ROS 的發(fā)生減少心肌細(xì)胞壞死。

綜上所述，以上結(jié)果初步提示RIP3/CaMKII 信號(hào)通路在CVB3 誘導(dǎo)的重癥病毒性心肌炎大鼠模型中起到重要作用，CaMKII 的抑制劑KN-93 通過阻斷RIP3 的信號(hào)傳導(dǎo)能夠顯著減輕心肌細(xì)胞損傷，顯著改善心臟功能和生存曲線，其機(jī)制可能通過抑制CaMKII 磷酸化和ROS 產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)。這也提示我們RIP3/CaMKII信號(hào)通路在本模型中的重要作用，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。