呼吸道感染性疾病病原學(xué)診斷的挑戰(zhàn)與解決策略

胡晏寧，魯炳懷

人體的呼吸道與外界相通，感染病原學(xué)類別非常復(fù)雜，涵蓋細菌、真菌、病毒，甚至寄生蟲的感染。下呼吸道感染(low respiratory tract infection，LRTI)是全球人類最常見的感染性疾病之一。呼吸道感染所致的肺炎是人群發(fā)病和死亡的重要原因，通常對老年和免疫力功能低下群體影響較大[1,2]。盡管有多種實驗室診斷方法可用，但仍有約40%需要住院治療的社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)患者的致病病原體難以確診，所以實驗室診斷的準確性和有效性的提高有重要意義[3]。包括培養(yǎng)在內(nèi)的傳統(tǒng)檢測方法在改良的同時依然被認為是病原體檢測的“金標(biāo)準”，分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展在近年來廣泛用于呼吸道病原體微生物學(xué)診斷[4～7]。

1 呼吸道感染病原體檢測技術(shù)的發(fā)展及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測方法

1.1.1 涂片染色鏡檢法 (1)染色方法較多，常用的是革蘭染色與抗酸染色。革蘭染色可用于區(qū)分革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌，易于操作。有報道稱球菌性肺炎病例檢測中革蘭染色法的靈敏度僅約80%[8]，特別是CAP人群的肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的感染?？顾崛旧梢酝怀鲲@示纖細的染成紅色的桿狀菌，對分枝桿菌的診斷特異性很高(90%～100%)，但靈敏度有限[3,9,10]。其他染色法如墨汁染色法對隱球菌診斷特異性較高，特別適合腦脊液樣本中隱球菌的染色，但是靈敏度差，應(yīng)與隱球菌莢膜多糖抗原試驗相結(jié)合。六胺銀染色適合經(jīng)典真菌、耶氏肺孢子菌的染色。對于真菌感染的痰與支氣管肺泡灌洗液樣本最常用的診斷方式是使用熒光素偶聯(lián)單克隆抗體的熒光染色[3]。(2)顯微鏡檢觀察細胞病變效應(yīng)是通過培養(yǎng)進行病毒鑒定的重要手段，如發(fā)現(xiàn)呼吸道樣本細胞中污跡樣嗜堿性包涵體可診斷為腺病毒感染[3]。感染細胞病變效應(yīng)還有巨細胞、合胞體形成、胞內(nèi)包涵體等。顯微鏡檢對特定檢測項目特異性較高，但較為費時耗力，近年來作為臨床診斷實驗，逐漸被分子生物學(xué)所取代。

1.1.2 抗原檢測法 指用已知病原體抗體檢測患者體內(nèi)有無相應(yīng)病原體抗原的方法，常用操作方法有乳膠凝集試驗、膠體金免疫層析法、直接熒光抗體試驗(direct fluorescent antibody test，DFA)等。如流感快速檢測首選方法，可以檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒等，使用方便且特異性高(90%～95%)，但靈敏度較低(40%～70%)，這意味著陰性結(jié)果不能排除流感病毒感染[8]。DFA可以檢測腺病毒、呼吸道合胞病毒等，特異性較高，但結(jié)果判讀可能有主觀性，對專業(yè)需求較高[11]。隱球菌感染的首選診斷方法為利用血清和腦脊液標(biāo)本進行乳膠凝集試驗或酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測隱球菌莢膜多糖抗原試驗。軍團菌肺炎的檢測可利用尿液軍團菌抗原Ⅰ型檢測與痰樣本瓊脂培養(yǎng)相結(jié)合做出診斷[3]。尿液中肺炎鏈球菌抗原的新型免疫層析測定法，用于肺炎鏈球菌肺炎的診斷，值得注意的是鑒于很多患者在樣本檢測時已經(jīng)開始了抗生素治療，樣本中很可能培養(yǎng)不出細菌但體內(nèi)抗原尚存，因此抗原檢測法在此方面彌補了染色鏡檢法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法的不足[3,12]。

1.1.3 培養(yǎng)法 痰樣本和支氣管灌洗液樣本一般在血平板、巧克力平板、麥康凱平板等接種培養(yǎng)，如同時懷疑血流感染，采用血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)病原體。臨床也可以針對不同病原微生物選用特殊培養(yǎng)基，利用BCYE選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)呼吸道分泌物是軍團菌感染檢測的金標(biāo)準，特異性很高，但靈敏度不高(50%～80%)[12]，此外，BCYE也可以用于諾卡菌的培養(yǎng)。對于診斷侵襲性曲霉菌病最明確的方法就是從正常無菌部位獲得樣本的陽性培養(yǎng)結(jié)果，一般選用沙氏培養(yǎng)基，但靈敏度較低。

1.1.4 血清學(xué)鑒定 指利用免疫學(xué)試驗的方法和原理，用已知病原微生物的抗原檢測患者體內(nèi)有無該病原的抗體來診斷是否感染，臨床常用操作方法有補體結(jié)合試驗(complement fixation test，CFT)、ELISA、顆粒凝集試驗、熒光抗體試驗(fluorescent antibody，F(xiàn)A)等。病原體特異性抗體通常在初次感染后2周左右出現(xiàn)，即可通過血清學(xué)檢測。在引入分子生物學(xué)檢測之前，病毒性呼吸道感染的主要診斷方法主要是基于血清學(xué)，包括檢測大量抗體升高與補體結(jié)合試驗[4]。非典型微生物如支原體、衣原體等的鑒定，提示上述微生物之一感染最可靠的血清學(xué)證據(jù)需要急性期和恢復(fù)期血清樣本之間的免疫球蛋白G抗體滴度增加4倍[12]。總體而言，對于呼吸道感染的病原學(xué)診斷，隨著分子生物學(xué)的廣泛開展，抗體檢測的價值在不斷弱化。

1.1.5 質(zhì)譜分析法 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)主要用于臨床培養(yǎng)陽性菌株的菌種鑒定，包括細菌與真菌，特別是生長緩慢的慢生長分枝桿菌與多種真菌，具有快速準確的優(yōu)勢[8,13,14]。但是MALDI-TOF MS靈敏度有限，一般不用來直接檢測呼吸道原始樣本中的病原微生物，無法縮短耗時的培養(yǎng)時間。

1.2分子生物學(xué)檢測方法

1.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測 PCR主要有普通PCR、實時熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)與數(shù)字PCR。RT-PCR廣泛用于臨床，了解的人較多。數(shù)字PCR中應(yīng)用最為廣泛的是微滴數(shù)字PCR，系統(tǒng)在PCR擴增前把測試樣本分割為無數(shù)水包油微滴，分割后每個微滴成為1個獨立的PCR反應(yīng)體系，理論上可以實現(xiàn)病原微生物的絕對定量，極大地提升了PCR靈敏度[15]。多數(shù)病原微生物PCR的臨床應(yīng)用價值均得到證實：(1)當(dāng)樣本量>100 000個微生物時，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的核酸探針的靈敏度和特異度可接近100%[3]；(2)流感病毒的檢測，PCR以其高靈敏度和特異度、更大的檢測時間窗和快速周轉(zhuǎn)時間，目前取代抗原檢測成為首選檢測方法[3,8]；(3)PCR對于呼吸機相關(guān)性肺炎患者支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)與甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)的檢出具有極好的預(yù)測值[3]。

1.2.2 多重快速PCR檢測 主要應(yīng)用多重引物，針對不同的病原體核酸或耐藥基因進行特異性擴增，可以同時檢測同一樣本中的細菌、病毒、支原體等臨床常見病原體及其耐藥基因[15]，在歐美等發(fā)達國家應(yīng)用較多，例如Curetis Unvvero P50、Xpert、eSensor、FilmArray等平臺，檢測時間極短(如Xpert檢測呼吸道病毒可在30 min內(nèi)完成)，操作簡便，但成本較高[11]。目前多重檢測的優(yōu)點是增加了識別呼吸道感染的微生物病原的機會，并且當(dāng)存在合并感染時，可以在單個時間點檢測一種以上的病原體。分子檢測到病毒不一定意味著感染，與受檢者的狀況以及病原類別有關(guān)[4,16]。多重PCR的技術(shù)難點：(1)引物與探針的設(shè)計，既要保持良好的靈敏性與特異性，又要采用特殊的技術(shù)避免引物探針間的結(jié)合，同時，還需要在操作平臺上全自動完成樣本處理、核酸提取、擴增、結(jié)果判讀等步驟，對于生產(chǎn)廠家而言的確構(gòu)成技術(shù)上的挑戰(zhàn)。(2)多重PCR的靶標(biāo)設(shè)計也是重要的問題，設(shè)置項目過多，將臨床罕見的病原納入，一方面增加了產(chǎn)品的設(shè)計難度，另一方面也會增加醫(yī)療負擔(dān)與患者承受能力。對于多重PCR的陽性結(jié)果，應(yīng)結(jié)合患者的具體情況、病原微生物的致病性等綜合判斷。如鼻病毒可在健康人鼻咽部定植，而甲型流感病毒很少有這種情況。

1.2.3 基于高通量測序技術(shù)的病原體核酸檢測 第二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)的發(fā)展，為臨床感染性疾病診斷帶來了突破性變革。針對臨床病原微生物的NGS檢測主要采用基于宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomics next generation sequencing,mNGS)[17～20]。mNGS的主要原理是將提取的病原微生物基因組DNA/RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增，然后隨機打斷為小片段DNA，再進行文庫構(gòu)建和上機測序等實驗流程，最終生成測序數(shù)據(jù)，由專業(yè)人員進行數(shù)據(jù)分析和結(jié)果報告。對于臨床而言，mNGS可以精準地分析患者樣本全部微生物，這一點對于感染性疾病的病原體研究具有極高的應(yīng)用價值。對于細菌檢測，mNGS技術(shù)不僅可以定量明確致病細菌，還可以獲取致病菌的基因分型、耐藥基因、進化水平和感染途徑等關(guān)鍵信息，指導(dǎo)臨床病原學(xué)診斷、疾病防治和疫苗研發(fā)[7]。對于病毒檢測，如新型冠狀病毒，mNGS可以準確獲取病毒的亞型以及耐藥進化等信息，對于暴發(fā)性疫病的控制、檢測與疫苗研發(fā)有重要意義；對于真菌檢測，它彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢出慢、靈敏度低的不足，為臨床快速檢出真菌提供了有力手段。因此mNGS為檢測臨床樣本中存在的任何病原體、其抗生素耐藥基因和新病原體發(fā)現(xiàn)提供了一種無偏倚的方法[1,15,19,21～23]。正是基于以上特點，mNGS近年來越來越多地用于臨床，臨床遇到疑難感染、多重感染時，該技術(shù)的確解決了很多疑難問題。但是，mNGS技術(shù)應(yīng)用中也應(yīng)注意一些問題：(1)mNGS在核酸提取的過程中，如果有很多破壁困難的微生物，包括分枝桿菌，諾卡菌，真菌中曲霉菌、毛霉菌、隱球菌、雙相真菌等，破壁都比較困難。導(dǎo)致檢測出序列數(shù)很低，臨床高度懷疑時，要采取其他的方法進行相關(guān)驗證。(2)mNGS的靈敏度較好，容易受環(huán)境微生物、工程菌、采集過程不適當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊?。因為對于mNGS的報告要合理解讀，不可將所有列出的微生物當(dāng)作病原微生物處理[24,25]。

2 呼吸道感染病原體檢測面臨的挑戰(zhàn)

呼吸道感染由許多病毒或細菌或真菌病原體引起，目前國內(nèi)的實驗室對于常見細菌診斷而言可能技術(shù)相對比較成熟，但對一些少見的細菌感染，比如結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、非結(jié)核分枝桿菌、厭氧菌，診斷能力尚有不足[9,26]。此外，在真菌方面，除了傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)，隱球菌采用隱球菌莢膜多糖抗原試驗[27,28]、曲霉菌采用半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)試驗等提高了診斷率[29]，但是在分子生物學(xué)診斷方面，目前國內(nèi)尚缺乏更好的手段。新冠肺炎疫情之前，國內(nèi)很多醫(yī)院對呼吸道病毒的檢測能力較弱，常常應(yīng)用抗原快檢方法，甚至選擇價值不大但操作相對方便的抗體檢測方案。疫情之后，國內(nèi)很多二級及以上醫(yī)院均建立分子生物學(xué)實驗室，這使得感染病原通過分子生物學(xué)鑒定在未來成為可能。同時，由于呼吸道感染診斷的耗時長、手段落后，臨床醫(yī)師通常根據(jù)經(jīng)驗處方使用廣譜抗生素用于治療感染，導(dǎo)致患者對抗菌藥物耐藥性的出現(xiàn)和傳播[4]。如肺炎鏈球菌引起CAP，發(fā)病急，進展快，可致患者死亡，特別是兒科患者，傳統(tǒng)的細菌涂片假陰性多見，而培養(yǎng)、鑒定耗時長，且肺炎鏈球菌采集、轉(zhuǎn)運、培養(yǎng)過程中易死亡，培養(yǎng)陽性率低。因此只有快速準確診斷呼吸道感染的病原微生物，才能減少抗生素過度使用并防止耐藥率進一步增加，以達到最佳臨床管控結(jié)果。

3 總結(jié)及展望

顯微鏡檢與培養(yǎng)手段在呼吸道感染尤其是免疫功能低下呼吸道感染者樣本診斷中發(fā)揮很重要的作用，代表著傳統(tǒng)病原體檢測方法依然保持金標(biāo)準的水平，各方面性能也在不斷改良；同時分子生物學(xué)檢測技術(shù)的進步展示了巨大前景，有望多方位彌補傳統(tǒng)檢測方法在靈敏性、特異性及檢測時間等各方面的不足而成為新一代金標(biāo)準。新舊技術(shù)的結(jié)合將提高我們更精確、更快速地檢測引起肺炎的微生物的能力?？梢灶A(yù)見，分子生物學(xué)檢測技術(shù)推動下的呼吸道病原體感染檢測技術(shù)未來必然朝著高通量、自動化的方向發(fā)展，成為感染性疾病診斷的主要方法。就目前的技術(shù)來看，mNGS尚不能解決快速病原診斷的問題，多數(shù)需要24 h甚至以上的時間，快速多重PCR多數(shù)在2 h內(nèi)出結(jié)果，應(yīng)用前景廣泛。但是，多重PCR畢竟靶病原有限，對于臨床疑難感染，mNGS有更廣闊的應(yīng)用空間[30,31]。