小鼠口腔癌不同時期淋巴結(jié)和骨髓的VEGF表達(dá)情況及其微環(huán)境對淋巴道轉(zhuǎn)移的影響

路 瑩，程 立，顏啟璋，陳 念，李 晶，郭夢竹，于大海

口腔鱗狀細(xì)胞癌是上皮來源口腔惡性腫瘤，主要發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵步驟是循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入二級或較遠(yuǎn)的器官部位，成為播散腫瘤細(xì)胞(disseminated tumor cell，DTC)[2]。DTC能否在遠(yuǎn)處器官定植、生長成瘤的影響因素很多[3,4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種分泌性生長因子，其主要作用是促進(jìn)血管生成，與腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在口腔癌發(fā)生、發(fā)展中的作用已有較多研究[5,6]。但是，關(guān)于口腔癌發(fā)展過程中淋巴結(jié)和骨髓內(nèi)的VEGF表達(dá)及其與DTC的相互作用尚無研究。在前期研究[7,8]中，本課題組成功使用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4-NQO)飲水法構(gòu)建了Balb/c小鼠口腔癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，該模型可以獲取口腔癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中不同時期的頜下淋巴結(jié)、骨髓進(jìn)行研究，且小鼠間個體差異小，可連續(xù)觀測，結(jié)果的可靠性及精確度較高。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究旨在觀察口腔癌發(fā)展各階段中骨髓、淋巴結(jié)微環(huán)境及癌細(xì)胞的VEGF表達(dá)情況，探討其在口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移靶向性的相互作用。

1 材料與方法

1.1動物來源與建模 選入40只6周齡雄性健康Balb/c小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)構(gòu)建小鼠口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型，將其隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組8只。建模方法[7,8]：用純水將4-NQO(購自Sigma，美國)配置成1%濃度，4 ℃冰箱保存。A組小鼠將自來水置于塑料瓶中，自由飲用。B～E組小鼠將配制好的4-NQO溶液以自來水稀釋成200 mg/L濃度置于避光飲水瓶內(nèi)，自由飲用，后改喂自來水。B組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水8周后改喂單純自來水，該時期小鼠舌部黏膜尚未出現(xiàn)病理改變，但已經(jīng)存在4-NQO藥物影響。C組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水20周后處死，該時期小鼠舌部黏膜已經(jīng)出現(xiàn)異常增生表現(xiàn)，但未形成癌癥。D組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水20周后改喂單純自來水4～8周，該時期小鼠已經(jīng)形成舌癌，但尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移。E組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水20周后改喂單純自來水8～12周，該時期小鼠口腔癌已經(jīng)形成，并伴有下頜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2標(biāo)本的獲取方法與檢測

1.2.1 標(biāo)本的獲取方法 (1)HE染色與免疫組化染色的標(biāo)本獲?。侯i椎脫臼法處死小鼠，切取小鼠舌體組織及雙側(cè)下頜下淋巴結(jié)，以福爾馬林溶液進(jìn)行固定。取雙側(cè)股骨，清洗去凈肌肉及軟骨組織，剪去股骨兩端，應(yīng)用注射器抽取1 ml生理鹽水，沖洗股骨骨髓至EDTA抗凝管，上下顛倒幾次后充分搖勻，置于冰盒內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?2)液相芯片法的標(biāo)本獲?。侯i椎脫臼法處死小鼠，取小鼠頜下淋巴結(jié)，放入DMEM培養(yǎng)液中剪碎研磨，過濾獲得單細(xì)胞懸液，作為淋巴結(jié)微環(huán)境樣本。應(yīng)用注射器抽取培養(yǎng)液沖出股骨骨髓，作為骨髓微環(huán)境樣本。

1.2.2 HE染色與免疫組化染色法檢測小鼠口腔癌分期 分別收集5組小鼠的舌體組織及頜下淋巴結(jié)組織，常規(guī)脫水包埋，連續(xù)5 μm切片，60 ℃烤片3 h。舌體組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組病理學(xué)特點(diǎn)。頜下淋巴結(jié)組織切片行Pan-CK免疫組化染色，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原，3% H2O2封閉處理，4 ℃下Pan-CK一抗(兔抗鼠多克隆抗體，博士德)孵育過夜，滴加二抗，室溫下孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色。采用已知Pan-CK抗體陽性組織作為陽性對照，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 免疫組化法檢測VEGF表達(dá) 收集5組小鼠的頜下淋巴結(jié)組織，常規(guī)脫水包埋，連續(xù)5 μm切片，60 ℃烤片3 h。滴1滴骨髓溶液至載玻片，將骨髓溶液向載玻片的另一端方向推動涂抹，直至骨髓鋪完成膜，室溫下晾干，4%多聚甲醛固定，制作骨髓涂片。免疫組織化學(xué)染色采用常規(guī)SP法。淋巴結(jié)組織石蠟切片脫蠟復(fù)水，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原。骨髓涂片0.5% Triton X-100室溫下孵育10 min。淋巴結(jié)組織切片及骨髓涂片均用H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。滴加VEGF一抗(兔單克隆抗體，濃度:1∶400，Abcam)，4 ℃孵育過夜。滴加二抗，室溫下孵育30 min，滴加DAB顯色，鏡下觀察并控制顯色時間。以已知VEGF抗體陽性組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[9]：VEGF表達(dá)于胞漿，以胞漿中出現(xiàn)明顯的棕黃色染色為陽性表達(dá)。

1.2.4 共培養(yǎng)模型建立 使用0.4 μm孔徑聚碳酸酯膜的Transwell小室，置于24孔板中。提前1 d將人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(SAS細(xì)胞，購自南京科佰生物科技有限公司)種入下室中，細(xì)胞密度5×104/ml。將取得的A、B、C、D各組淋巴結(jié)或骨髓微環(huán)境樣本放入上室中進(jìn)行共培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)組。將淋巴結(jié)或骨髓微環(huán)境置于上室中，下室不加入SAS細(xì)胞，僅有培養(yǎng)基作為對照組。均在共培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h后，收集微環(huán)境上清液，將上清液置入液氮中迅速冷凍，并保存于-80 ℃超低溫冰箱。共培養(yǎng)模型目的是模擬檢測VEGF的表達(dá)對骨髓、淋巴結(jié)中DTC影響，而E組已形成轉(zhuǎn)移癌，意味著DTC已增殖成瘤，因此未構(gòu)建E組共培養(yǎng)模型。由于每組僅取得1例樣本，未行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 液相芯片法檢測VEGF表達(dá) 按照VEGF液相芯片試劑盒(Thermo Invitrogen，美國)操作。取96孔板，每孔加50 μl預(yù)混微球，平放在磁性分離板上2 min后棄上清液，然后每孔加入1.2.4中的骨髓、淋巴結(jié)、共培養(yǎng)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各50 μl，室溫下振蕩反應(yīng)30 min，于4 ℃靜置過夜。棄上清液，每孔加入1×檢測抗體混合液25 μl，室溫震蕩反應(yīng)30 min，最后每孔加入SA-PE 50 μl。將96孔板從磁性分離板上取出，室溫震蕩反應(yīng)30 min，洗板后上機(jī)。采用Bio-Plex 200檢測系統(tǒng)檢測樣本的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度計(jì)算各樣本細(xì)胞因子濃度。判定方法：采用五參數(shù)非線性回歸的方式擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出濃度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠舌部HE染色及頜下淋巴結(jié)Pan-CK免疫組化染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，A組、B組小鼠舌部未見病理改變；C組可見上皮釘突明顯增長，細(xì)胞呈多形性，出現(xiàn)有絲分裂；D組、E組細(xì)胞呈團(tuán)塊樣排列，中心部分可見角化珠。A、B、C、D組頜下淋巴結(jié)Pan-CK免疫組化染色呈陰性；E組可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)成片分布的Pan-CK陽性染色細(xì)胞，著色深，提示小鼠已發(fā)生口腔癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見圖1。

2.2各組小鼠骨髓中VEGF表達(dá)情況 VEGF免疫組化染色結(jié)果顯示，陽性染色細(xì)胞于胞漿內(nèi)著色，同一張玻片不同視野即可見陽性染色的細(xì)胞表達(dá)情況有明顯差異。骨髓涂片上骨髓細(xì)胞散在且分布稀疏，且由于不同視野下細(xì)胞數(shù)量及陽性表達(dá)細(xì)胞差距較大，因此難以進(jìn)行評估分析。見圖2。

2.3各組小鼠頜下淋巴結(jié)中VEGF表達(dá)情況 VEGF免疫組化染色結(jié)果顯示，5組淋巴結(jié)均可見VEGF表達(dá)，胞漿染色陽性。A組呈聚集分布；B組少許散在的點(diǎn)狀分布；C組陽性染色細(xì)胞較多，開始聚集；D組可見大量陽性染色細(xì)胞聚集；E組陽性染色的細(xì)胞呈大塊片狀聚集。見圖3。

圖1 各組小鼠舌部HE染色及頜下淋巴結(jié)Pan-CK免疫組化染色所見(×200)

?VEGF陽性染色的細(xì)胞數(shù)量少，著色淺；?陽性染色的細(xì)胞數(shù)量多且著色深

黑色箭頭所指為陽性染色

2.4各組小鼠骨髓和淋巴結(jié)的VEGF表達(dá)比較 液相芯片法檢測結(jié)果顯示，對于淋巴結(jié)組織，A組VEGF表達(dá)水平顯著高于C組和D組(P<0.05)，E組顯著高于C組(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對于骨髓組織，A組和B組VEGF表達(dá)水平顯著高于C組、D組和E組(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5組小鼠骨髓組織的VEGF表達(dá)水平均顯著高于淋巴結(jié)組織(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠骨髓和淋巴結(jié)的VEGF表達(dá)比較[M(P25,P75)，pg/ml]

2.5各組小鼠SAS細(xì)胞在不同時期淋巴結(jié)及骨髓微環(huán)境中各時間點(diǎn)VEGF的表達(dá)情況 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A組、B組和C組時期的淋巴結(jié)和骨髓微環(huán)境中，SAS細(xì)胞在24～72 h時段內(nèi)的VEGF表達(dá)呈上升趨勢。而在D組時期淋巴結(jié)微環(huán)境中，SAS細(xì)胞在24～72 h時段內(nèi)的VEGF的表達(dá)呈下降趨勢，但在D組時期骨髓微環(huán)境中，SAS細(xì)胞在24～72 h時段內(nèi)的VEGF的表達(dá)呈上升趨勢。見表2。

表2 各組小鼠SAS細(xì)胞在不同時期淋巴結(jié)及骨髓微環(huán)境中各時間點(diǎn)VEGF的表達(dá)情況(pg/ml)

3 討論

3.1Schwonzen等[10]的研究表明，骨髓涂片檢查不能如實(shí)反映骨髓情況。本實(shí)驗(yàn)的骨髓涂片免疫組化結(jié)果也顯示，在不同高倍鏡視野下，陽性染色的細(xì)胞表達(dá)差異較大。且受實(shí)驗(yàn)者操作的影響，不同涂片間的誤差也較大，導(dǎo)致其免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果不可靠。Aguirre-Ghiso[11]認(rèn)為腫瘤休眠可分為免疫休眠、細(xì)胞休眠以及血管休眠。本課題組的前期研究[12]發(fā)現(xiàn)，不同微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞有著不同作用，可影響腫瘤細(xì)胞的增殖與休眠，最終被動形成淋巴道轉(zhuǎn)移的靶向性。Kazerounian和Lawler[13]的研究表明，血管休眠機(jī)制是指通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生長的因素,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺氧和營養(yǎng)剝奪而使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)。血管生成是腫瘤生長和進(jìn)展的標(biāo)志,腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有血管依賴性。另一方面，本課題組在研究過程中發(fā)現(xiàn)免疫介導(dǎo)的休眠參與了口腔癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移靶向性的形成。在口腔癌發(fā)生、發(fā)展直至轉(zhuǎn)移的過程中，小鼠骨髓內(nèi)CD4+/CD8+T細(xì)胞比值呈上升趨勢；而在淋巴結(jié)內(nèi)，轉(zhuǎn)移癌期CD4+/CD8+T細(xì)胞比值下降，免疫失衡，造成機(jī)體識別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力下降。這種骨髓及淋巴結(jié)微環(huán)境中免疫狀態(tài)的差異，是使骨髓內(nèi)DTC保持休眠狀態(tài)，而淋巴結(jié)內(nèi)DTC增殖的原因之一。Shiozawa等[14]研究發(fā)現(xiàn)骨髓中的造血干細(xì)胞可以分泌生長停滯特異性蛋白6(growth arrest specific protein 6,GAS6)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)、轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor β2,TGFβ2)等，通過細(xì)胞休眠機(jī)制，可抑制骨髓內(nèi)DTC增殖成瘤。

3.2Murrell等[15]認(rèn)為在微環(huán)境改變時，DTC被“喚醒”，從而在該微環(huán)境被動時發(fā)生了轉(zhuǎn)移。Nishida等[16]的研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展依賴于新生血管的生成，腫瘤細(xì)胞可通過合成和分泌血管生成因子調(diào)節(jié)腫瘤組織的血管生成。VEGF不僅可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體誘導(dǎo)血管形成，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，而且還可通過作用于腫瘤細(xì)胞上的受體，直接促進(jìn)腫瘤生長。VEGF作為特異內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂素，是主要的血管生成因子，可增加血管通透性，促進(jìn)腫瘤血管形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)成瘤干預(yù)8周小鼠的淋巴結(jié)組織的VEGF的表達(dá)水平先出現(xiàn)降低，但隨著病情的進(jìn)展，VEGF的表達(dá)水平又逐漸上升，并在轉(zhuǎn)移期達(dá)到最高水平。VEGF是腫瘤血管發(fā)生過程中的主要正性調(diào)控因子，通過促血管生成作用，參與腫瘤的發(fā)展過程。且由于淋巴結(jié)內(nèi)免疫失衡，缺乏骨髓內(nèi)存在的造血干細(xì)胞等因素，未能分泌相關(guān)抑制因子，因而未能抑制DTC增殖。VEGF在淋巴結(jié)組織的表達(dá)上升，促進(jìn)血管生成，增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3Lech-Maranda等[17]的研究表明VEGF能夠增加血管通透性,導(dǎo)致血漿蛋白和纖維蛋白及液體經(jīng)血管外滲而引起細(xì)胞外基質(zhì)改變,有效促進(jìn)血管和新基質(zhì)形成,為腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組和B組骨髓組織的VEGF表達(dá)水平顯著高于C組、D組和E組。骨髓組織VEGF的表達(dá)降低可能是免疫功能增強(qiáng)及其他細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果。而當(dāng)VEGF在骨髓內(nèi)的表達(dá)下降，血管生成受到抑制，使骨髓內(nèi)DTC處于血管休眠狀態(tài)，未能形成骨髓轉(zhuǎn)移。盡管本研究液相芯片的結(jié)果顯示，小鼠骨髓組織的VEGF表達(dá)水平顯著高于淋巴結(jié)組織，但是由于淋巴結(jié)內(nèi)免疫失衡，且缺乏骨髓內(nèi)存在的造血干細(xì)胞，未能分泌相關(guān)抑制因子，故未能形成DTC免疫休眠及細(xì)胞休眠，因而不能抑制DTC增殖，并通過VEGF表達(dá)上升，血管生成增加而成瘤。而骨髓組織可通過免疫、細(xì)胞及血管休眠的協(xié)同作用使DTC處于休眠狀態(tài)，抑制增殖成瘤。這與臨床上口腔癌多為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，很少發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象相一致。

3.4由于本課題組的前期研究[18]發(fā)現(xiàn)在中重度異常增生時期，DTC已經(jīng)進(jìn)入骨髓和淋巴結(jié)中，由此推測從該時期始，DTC可能已經(jīng)對組織微環(huán)境造成影響。在腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移時期，DTC數(shù)目增多，也是惡性程度不斷上升的細(xì)胞累積過程[19]。本研究中共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，除D組時期骨髓微環(huán)境中SAS細(xì)胞在24～72 h時段內(nèi)的VEGF的表達(dá)呈下降趨勢外，在其余組別時期的骨髓或淋巴結(jié)微環(huán)境均促進(jìn)了SAS細(xì)胞在24～72 h時段內(nèi)VEGF的表達(dá)?？紤]為由于D組時期骨髓組織中其他細(xì)胞因子的影響，抑制了VEGF的分泌，導(dǎo)致其表達(dá)下降，這可能也是口腔癌較少骨髓轉(zhuǎn)移的原因之一，有待進(jìn)一步開展研究驗(yàn)證。由于在轉(zhuǎn)移癌形成之前，微環(huán)境內(nèi)僅有散在分布的DTC，其可能僅影響細(xì)胞周圍微環(huán)境中VEGF的表達(dá)，而對于整個淋巴結(jié)或骨髓微環(huán)境影響作用較小。隨著DTC累積增多，當(dāng)其對VEGF的促進(jìn)作用超過了微環(huán)境中其他因素抑制其表達(dá)的能力，VEGF則表達(dá)升高，從而促進(jìn)DTC團(tuán)塊血管生成[20,21]。DTC增殖和VEGF表達(dá)形成了相互促進(jìn)的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，無論是組織檢測還是共培養(yǎng)，A組的VEGF表達(dá)均高于B組、C組和D組，這可能是由于4-NQO藥物對小鼠機(jī)體早期影響所造成，當(dāng)機(jī)體適應(yīng)了藥物的影響，VEGF逐漸隨疾病進(jìn)展持續(xù)升高。

綜上所述，骨髓和淋巴結(jié)組織微環(huán)境可與DTC相互影響，共同作用，這可能是口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶向性的機(jī)制之一。