崔 科，白 霞，剡紅民，賈 婷，強(qiáng) 榮

(西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 710061)

單個(gè)受精卵產(chǎn)生并具有兩種或多種不同基因型的細(xì)胞群的個(gè)體稱為嵌合體，其中具有兩種或多種性染色體核型的嵌合體為性染色體嵌合體[1]。性染色體嵌合可能會(huì)導(dǎo)致胎兒性器官發(fā)育不完全，增加生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且異常核型位置、所占比例等的多樣性增大了產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢的復(fù)雜性[2]。染色體核型分析技術(shù)是產(chǎn)前診斷中染色體嵌合體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可以檢出非整倍體以及較大片段的核型異常，但其診斷周期長，且對于染色體的微小缺失和重復(fù)無法明確診斷，而染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)、染色體拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)檢測對于染色體微缺失/微重復(fù)等的檢出具有獨(dú)特優(yōu)勢，但不能檢出染色體平衡易位、倒位以及低比例異常嵌合[3]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)可以直接檢測未培養(yǎng)羊水細(xì)胞間期細(xì)胞，明確胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常的來源和準(zhǔn)確定位斷裂點(diǎn)，對最常見的非整倍體作出快速的產(chǎn)前診斷[4]。

本研究擬探討細(xì)胞和分子遺傳學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用在性染色體嵌合體產(chǎn)前診斷中的價(jià)值，以為羊水性染色體嵌合體的遺傳咨詢提供參考。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2018年1月至2020年12月在西北婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心符合介入性產(chǎn)前診斷指征并行羊膜腔穿刺術(shù)，接受細(xì)胞和/或分子遺傳學(xué)分析的5 158名孕婦為研究對象，其中染色體核型分析和FISH檢測各5 158例，CMA檢測2 542例，CNV檢測770例，進(jìn)一步分析40例性染色體嵌合體病例，對妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪。所有孕婦及家屬均進(jìn)行檢測前咨詢，并簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2檢測方法

1.2.1采集羊水標(biāo)本

經(jīng)知情同意，孕婦在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水30～40mL(棄去最初的1～2mL，以避免母體細(xì)胞污染)，其中羊水細(xì)胞染色體核型分析培養(yǎng)20mL，F(xiàn)ISH檢測10mL，CMA/CNV檢測10mL。

1.2.2染色體核型分析

將20mL羊水分別注入2支無菌離心管，離心后在無菌操作條件下接種于2個(gè)培養(yǎng)瓶中，獨(dú)立于2個(gè)培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)條件為37℃和5%～6%CO2。觀察細(xì)胞生長情況，7d后換液，上清液置于第3個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)備用，原培養(yǎng)瓶加培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。2～3d后，進(jìn)行原位收獲、制片和常規(guī)G顯帶。計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相細(xì)胞，分析5個(gè)核型，記錄染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常情況，若出現(xiàn)嵌合型或異常核型則加大計(jì)數(shù)。

1.2.3 FISH檢測

對10mL羊水標(biāo)本選用產(chǎn)前診斷染色體檢測試劑盒探針(北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)，按說明書進(jìn)行常規(guī)操作處理。其中綠色的CSPX探針定位于Xp11.1-q11.1，紅色的CSPY探針位于Yp11.1-q11.1。熒光顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行分析計(jì)數(shù)，正常細(xì)胞占比>90%為正常樣本，異常細(xì)胞占比>60%為異常樣本，異常細(xì)胞占比10%～60%為嵌合型。

1.2.4 CMA/CNV檢測

對未培養(yǎng)的10mL羊水，按照Wizard?基因組DNA 純化試劑盒(中國北京天根生化公司)說明書進(jìn)行操作，提取基因組DNA。知情同意后，根據(jù)孕婦的選擇，進(jìn)行CMA或CNV檢測。CMA檢測：選取SurePrint G3 Human CGH Microarray 8×60K CGH芯片(美國 Agilent 公司)，操作步驟嚴(yán)格遵循Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit試劑盒說明書。CNV檢測：使用NextSeq CN500測序平臺(tái)測序。參考DGV、UCSC、DECIPHER、ISCA、ClinGen、OMIM、NCBI PubMed等數(shù)據(jù)庫對檢測出的CNVs進(jìn)行解釋和分析。

1.3診斷標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)兩種及以上培養(yǎng)物中均出現(xiàn)兩個(gè)及以上的異常核型且異常核型相同為真嵌合體；兩種及以上培養(yǎng)物中均出現(xiàn)不同的異常核型，或兩種及以上培養(yǎng)物中只存在單個(gè)異常細(xì)胞，或不同核型均只在相同培養(yǎng)物中存在為假嵌合體[5]。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前診斷指征

5 158例羊水樣本中檢出40例性染色體嵌合體，發(fā)生率為0.78%。產(chǎn)前診斷指征包括無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(noninvasive prenatal testing，NIPT)異常(26例，65.00%)、NIPT性染色體異常(4例，10.00%)、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)(4例，10.00%)、高齡(3例，7.50%)、羊水過多(1例，2.50%)、羊水偏多(1例，2.50%)和單臍動(dòng)脈(1例，2.50%)，見表1。

2.2染色體核型分析結(jié)果

檢出的40例性染色體嵌合體中，5例(12.50%)為染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合體，35例(87.50%)為染色體數(shù)目異常嵌合體，見表1。染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合體的具體情況為：(1)病例1：染色體核型分析顯示其存在45,X和疑似衍生X染色體46,X,?der(X)兩種細(xì)胞系，結(jié)合FISH及CNV檢測結(jié)果，確定染色體核型為45,X[61]/46,X,psu idic(X)(p11.4)[39]，結(jié)構(gòu)異常X染色體為假雙著絲粒染色體。(2)病例2和3：染色體核型分析顯示其為45,X和46,X,i(X)嵌合核型，經(jīng)CMA檢測準(zhǔn)確定位，確定結(jié)構(gòu)異常X染色體為i(X)(qter→q10::q10→qter)。(3)病例4：染色體核型分析顯示其為45,X和46,X,del(X)嵌合核型，經(jīng)CMA檢測準(zhǔn)確定位，確定結(jié)構(gòu)異常X染色體為del(X)(pter→q21:)。(4)病例5：見FISH檢測結(jié)果。

2.3 FISH檢測結(jié)果

在選擇FISH檢測的40例(100.00%)孕婦中，37例(92.50%)檢測結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果一致，3例(7.50%)檢測結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果不一致(見表1)，具體情況為：(1)病例5：染色體核型分析顯示其為45,X[23]/46,X,?del(Y)(q11.21)[26]嵌合體核型，但FISH檢測提示為X[23]/XYYY[45]/47,XYY[32]，結(jié)合CMA檢測結(jié)果，推測：①該樣本中同時(shí)存在X、XYYY和XYY三種細(xì)胞系；②XYYY細(xì)胞系中，除了正常Y染色體，還有雙著絲粒Y染色體；③XYY細(xì)胞系中，Y染色體是雙著絲粒染色體。(2)病例6：染色體核型分析顯示其為45,X[30]/46,XY[23]嵌合體核型，但FISH檢測提示為X[20]/XYY[70]/46,XY[10]，結(jié)合CMA檢測結(jié)果，推測：①該樣本中同時(shí)存在X、XYY和XY三種細(xì)胞系；②XYY細(xì)胞系中的Y染色體是雙著絲粒染色體。(3)病例7：染色體核型分析顯示其為45,X[15]/46,XY[26]嵌合體核型，但FISH檢測提示為X[12]/XYY[68]/XY[26]，結(jié)合CMA檢測結(jié)果，推測：①該樣本中同時(shí)存在X、XYY和XY三種細(xì)胞系；②XYY細(xì)胞系中的Y染色體是雙著絲粒染色體。

2.4 CMA/CNV檢測結(jié)果

在選擇CMA/CNV檢測的28例(70.00%)孕婦中，22例(78.57%)檢測結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果一致，6例(21.43)檢測結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果不一致，見表1。

2.5 妊娠結(jié)局

檢出的40例性染色體嵌合體中，31例選擇終止妊娠(病例13因胎兒胎心減慢引產(chǎn))，終止妊娠率為77.50%；9例選擇繼續(xù)妊娠(8例順產(chǎn)，1例剖宮產(chǎn)，均未見異常，病例2 性染色體異常細(xì)胞系比例較高)，繼續(xù)妊娠率為22.50%，見表1。

表1 40例性染色體嵌合體的臨床資料和遺傳學(xué)檢測結(jié)果Table 1 Clinical data and genetic test results of the 40 cases with sex chromosome mosaicism

3討論

3.1 性染色體嵌合體的臨床特征

染色體嵌合體形成的主要原因?yàn)槭芫笥薪z分裂期間的不分離錯(cuò)誤或染色體丟失，在染色體正常的受精卵中，異常核型細(xì)胞出現(xiàn)得越早，其所占比例越大[6]。NIPT通過檢測母體血漿中的胎兒游離 DNA來篩查胎兒非整倍體，已經(jīng)被廣泛用于21三體、18三體和13三體的產(chǎn)前篩查。盡管NIPT對嵌合體檢測的靈敏度和特異度較低，但仍具有重要的提示作用。本研究表明性染色體嵌合體的產(chǎn)前診斷指征主要為NIPT異常，劉文等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)42.11%的胎兒染色體嵌合體的羊水標(biāo)本為NIPT提示異常的標(biāo)本。本研究中77.50%的檢測出性染色體嵌合體的孕婦選擇引產(chǎn)，高于既往研究的終止妊娠率[8]。雖然染色體嵌合的臨床表現(xiàn)與異常染色體的數(shù)目和種類有關(guān)，但發(fā)育障礙與染色體嵌合比例的關(guān)系尚未有定論，且性染色體嵌合體常在青春期后才出現(xiàn)生殖器發(fā)育異常、生育能力低下等癥狀，因此對性染色體嵌合體的遺傳咨詢?nèi)孕柚?jǐn)慎解釋，合理選擇是否終止妊娠。

3.2 細(xì)胞和分子遺傳學(xué)技術(shù)的對比

傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析技術(shù)可以檢出染色體數(shù)目異常和部分結(jié)構(gòu)重排，但不能準(zhǔn)確診斷染色體小片段結(jié)構(gòu)異常和復(fù)雜易位斷裂點(diǎn)。本研究中染色體核型分析技術(shù)無法分辨出病例1～4的假雙著絲粒染色體、確定結(jié)構(gòu)異常染色體具體的斷裂點(diǎn)，而聯(lián)合CMA/CNV分子遺傳學(xué)技術(shù)，不僅可以檢測微小缺失或重復(fù)，還可以綜合分析檢測結(jié)構(gòu)，確定突變類型或定位微缺失/重復(fù)斷裂點(diǎn)等[9]。在病例5～7中，由于FISH和CMA/CNV檢測采用培養(yǎng)前的羊水標(biāo)本，檢測出的45,X細(xì)胞所占比例低。而進(jìn)行染色體核型分析時(shí)，由于45,X細(xì)胞系為優(yōu)勢生長趨勢明顯的細(xì)胞系，羊水培養(yǎng)后該細(xì)胞系比例高，染色體結(jié)構(gòu)異常的XYY和XYYY細(xì)胞系比例較低，且雙著絲粒Y染色體在300-500條帶的G顯帶時(shí)不易分辨，導(dǎo)致核型未能檢出。因此，由于采用培養(yǎng)前的羊水標(biāo)本，避免了細(xì)胞培養(yǎng)后優(yōu)勢細(xì)胞增長等情況，F(xiàn)ISH和CMA/CNV分子遺傳學(xué)技術(shù)的檢測結(jié)果更能真實(shí)反應(yīng)樣本情況[10,11]。本研究顯示部分CMA/CNV檢測結(jié)果與染色體核型分析及FISH檢測結(jié)果不一致，可能是由于CMA/CNV技術(shù)在檢測過程中需要對樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使得原有嵌合比例發(fā)生變化，導(dǎo)致無法檢出較低比例嵌合體。李顯箏等[12]也認(rèn)為對低比例嵌合體的產(chǎn)前診斷，F(xiàn)ISH檢測優(yōu)于CMA/CNV檢測。

3.3 細(xì)胞和分子遺傳學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用在產(chǎn)前診斷的價(jià)值

羊水染色體核型分析是目前最常用且可靠性較高的產(chǎn)前診斷細(xì)胞遺傳學(xué)方法，但其細(xì)胞培養(yǎng)周期較長、檢測分辨率低，存在漏診和誤診的可能性。真嵌合會(huì)出現(xiàn)多種器官和智力發(fā)育障礙，而假嵌合會(huì)導(dǎo)致不必要的產(chǎn)前干預(yù)，給孕婦及其家屬帶來極大的身體和心理負(fù)擔(dān)[13]。FISH和CMA/CNV分子遺傳學(xué)技術(shù)具有診斷周期短、高通量、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。聯(lián)合細(xì)胞和分子遺傳學(xué)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)不同檢測方法的優(yōu)勢互補(bǔ)，有效提高產(chǎn)前診斷性染色體嵌合體的準(zhǔn)確性。本研究表明FISH和CMA/CNV檢測與染色體核型分析結(jié)果具有較高的一致性。Dai等[14]對4 953例具有羊膜腔穿刺術(shù)指征的孕婦進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體核型分析和FISH檢測進(jìn)行產(chǎn)前診斷，3例為性染色體嵌合體。Zhang等[15]對104例染色體嵌合體進(jìn)行分析，其中28例聯(lián)合應(yīng)用染色體核型分析和CMV檢測，其認(rèn)為需要采用不同的檢測方法對性染色體嵌合的檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。因此，在性染色體嵌合體的產(chǎn)前診斷中聯(lián)合細(xì)胞和分子遺傳學(xué)技術(shù)有助于避免醫(yī)生誤判，有針對性地開展遺傳咨詢，有效減少對孕婦及其家屬的身心傷害。

綜上所述，羊水染色體核型分析是產(chǎn)前診斷性染色體嵌合體的重要方法，應(yīng)聯(lián)合細(xì)胞和分子遺傳學(xué)檢測技術(shù)全面地對性染色體嵌合體進(jìn)行鑒別性產(chǎn)前診斷，以為羊水性染色體嵌合體的遺傳咨詢提供參考。