黃曉霞，趙唯君，吳相親，王凱洋，曾 露，王紅剛，梁生旺，羅 蘭

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

0 引言

血瘀證是由瘀血內(nèi)阻引起的病癥，是中醫(yī)證候研究領(lǐng)域的熱點[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血瘀證主要表現(xiàn)在血流動力學(xué)、血液流變學(xué)、血栓、微循環(huán)障礙、血管內(nèi)皮損傷、炎癥等方面，會導(dǎo)致各組織器官水腫、炎癥滲出、血栓形成、組織變性、結(jié)締組織增生等病理變化，是臨床上常見的證候之一[2-4]。有研究表明，蒲黃(Pollentyphae)對血瘀證具有比較明確的治療作用，如孔祥鵬等[5]通過對血瘀模型大鼠的研究，認(rèn)為蒲黃可改變異常的血液流變學(xué)，降低纖維蛋白原含量從而起到化瘀的作用；劉鵬和周軍[6]認(rèn)為蒲黃可以改變局部血液循環(huán)，促進(jìn)血管及纖維組織增生；楊梓超等[7]研究發(fā)現(xiàn),蒲黃提取物可以下調(diào)糖尿病視網(wǎng)膜病變中的炎癥水平；過鑫昌等[8]通過臨床雙盲實驗研究證實蒲黃能影響血脂，降低血清總膽固醇含量，降低血小板黏附率，從而影響血小板功能，對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有修復(fù)作用并抑制粥樣斑塊的形成。目前，作為活血化瘀藥，蒲黃對血液流變學(xué)指標(biāo)有改善作用[9]，且可改善糖尿病大鼠血液中炎癥因子的水平[10]，對急性血瘀大鼠的藥代動力學(xué)作用明顯[11]，但其發(fā)揮治療作用的可能藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不明確。

蒲黃主要含有黃酮類、甾體、有機(jī)酸、烷烴、揮發(fā)油、多糖等化學(xué)物質(zhì)[12]，具有止血、化瘀、通淋等功效。蒲黃總黃酮可顯著改善急性血瘀證家兔的血液流變學(xué)，并抑制血小板聚集[13]；Wang等[14]研究表明，蒲黃總黃酮是活血化瘀的主要活性成分。蒲黃黃酮類成分槲皮素、異鼠李素、柚皮素等均可抑制血小板聚集[15-17]；花生四烯酸在體內(nèi)被迅速代謝，其代謝物參與細(xì)胞免疫及炎癥反應(yīng)[18]；山奈酚可抑制炎癥因子，具有抗炎作用[19]。上述研究成果揭示以上化合物可能是治療血瘀證的主要活性成分。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(Network pharmacology)基于在線的數(shù)據(jù)庫、平臺和作圖軟件等，依據(jù)中藥多成分、多靶點、多途徑的整體研究思路，通過數(shù)據(jù)挖掘、分析以及數(shù)據(jù)可視化等闡明藥物的分子作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。前期本實驗課題組采用LC-MS方法對蒲黃中的主要化學(xué)成分進(jìn)行定量分析[20]，本實驗基于整體觀，在前期研究基礎(chǔ)上采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選蒲黃活性成分及其作用靶點、通路，保留與血瘀證相關(guān)的靶點，并與陽性藥阿司匹林分子對接強(qiáng)度比較，以此探討其治療血瘀證的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 蒲黃活性成分和作用靶點的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索蒲黃全部的化學(xué)成分，以口服利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-Likeness，DL)≥0.18兩個ADME (藥物在體內(nèi)的吸收Absorption、分布Distribution、代謝Metabolism、排泄Excretion過程)參數(shù)為篩選條件，初步篩選出蒲黃活性成分及其作用靶點，并根據(jù)潘祥龍等[2]的研究成果補(bǔ)充蒲黃中具有活血化瘀功效的化合物。經(jīng)文獻(xiàn)篩選補(bǔ)充的化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索匹配，若TCMSP未收載，則利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物分子的3D結(jié)構(gòu)并導(dǎo)入Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測活性成分的作用靶點。對獲得的蛋白質(zhì)靶點統(tǒng)一使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 蒲黃活性成分作用靶點的篩選

將1.1節(jié)初步篩選出的作用靶點輸入PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https:/org//www.Pharmgk-b)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.i drblab.net/ttd/)、CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdb ase.org/)，篩選出蒲黃活性成分的作用靶點，保留與血瘀證相關(guān)的靶點，舍去非相關(guān)靶點。

1.3 蒲黃成分-靶點圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.8.2對結(jié)果進(jìn)行可視化，構(gòu)建蒲黃成分-靶點圖，用“節(jié)點(node)”表示成分或靶點或通路，用“邊(edge)”表示節(jié)點之間的關(guān)系。利用Cytoscape3.8.2軟件內(nèi)置工具(network analyzer)分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，以連接度(Degree)、介度(Betweenness Centrality)與緊密度(Closeness Centrality)的數(shù)值為主要參考，識別活性成分、作用靶點和通路。

1.4 蒲黃活性成分作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明晰靶點間的相互作用，將1.2節(jié)篩選出的蒲黃活性成分作用靶點提交到STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，以“Homo sapiens”為篩選條件，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定閾值“highest confidence”>0.9，其余條件均為默認(rèn)。利用Metascape平臺(https://metascape.org/gp/index.html)挖掘PPI網(wǎng)絡(luò)中潛在的功能模塊，并對功能模塊進(jìn)行描述。

1.5 疾病-靶點圖構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.8.2對結(jié)果進(jìn)行可視化，構(gòu)建疾病-靶點圖，其他步驟與1.3節(jié)一致。

1.6 蒲黃活性成分作用靶點功能與通路富集分析

利用Metascape平臺將蒲黃活性成分作用靶點進(jìn)行基因本體論GO生物過程分析(GO Biological Processes)、GO分子功能分析(GO Molecular Functions)、GO細(xì)胞組分分析(GO Cellular Components)、KEGG通路富集分析(KEGG Pathway)，分析條件均為默認(rèn)參數(shù)，并對所得結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 蒲黃成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.8.2對結(jié)果進(jìn)行可視化，構(gòu)建成分-靶點-通路圖，其他步驟與1.3節(jié)一致。

1.8 分子對接分析

為進(jìn)一步明晰化合物與靶點結(jié)合的活性，利用AutoDock Vina(v4.2.6)軟件對蒲黃的活性成分和關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行分子對接，同時將陽性藥阿司匹林Aspirin與關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行分子對接。分子對接的步驟主要如下：①收集蒲黃活性成分作用的關(guān)鍵靶點的結(jié)構(gòu)和活性成分的結(jié)構(gòu)——從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵作用靶點的3D結(jié)構(gòu)，從TCMSP和Pubchem數(shù)據(jù)庫下載活性成分的mol2或3D結(jié)構(gòu)；②對關(guān)鍵作用靶點和活性成分進(jìn)行預(yù)處理——使用Discovery Studio 4.5對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理，刪除水分子、配體、離子，加極性氫和電荷等，并將化合物轉(zhuǎn)成PDB文件；③配體(活性成分)和分子(靶點)的對接——對接過程中，將蒲黃活性成分和關(guān)鍵作用靶點的PDB文件轉(zhuǎn)化成pdbqt文件，通過查閱文獻(xiàn)設(shè)置盒子參數(shù)，而后進(jìn)行柔性對接；④對接結(jié)果的可視化——使用PyMOL(2.4.1)將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲黃活性成分的獲取

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集33個化學(xué)成分，經(jīng)ADME篩選得到8個活性成分，加上潘祥龍等[2]報道的活性成分8個，總共16個活性成分(表1)。

表1 蒲黃活性成分

2.2 蒲黃活性成分作用靶點的確定

通過在線數(shù)據(jù)庫對蒲黃活性成分的作用靶點進(jìn)行收集，共獲得539個靶點，去除重復(fù)靶點后為310個。將310個靶點錄入CTD、TTD和PharmGKB數(shù)據(jù)庫，對靶點進(jìn)行分類，主要根據(jù)改善血流動力學(xué)、抗凝血、抗炎和調(diào)控細(xì)胞凋亡(增殖)等4個方向進(jìn)行分類[21]。最終確定與血瘀證相關(guān)的作用靶點83個，并與蒲黃16個活性成分相互作用。

2.3 蒲黃成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

為觀察蒲黃活性成分和靶點之間的關(guān)系，使用Cytoscape3.8.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，獲得成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點98個，邊166條(圖1)。拓?fù)鋵傩苑治鲲@示，槲皮素、7-羥基-5,8-二甲氧基-黃烷酮、山奈酚的連接度較高(表2)。

圖1 蒲黃成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 蒲黃活性成分的拓?fù)鋵傩?/p>

2.4 蒲黃活性成分作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過提交靶點至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，獲得蒲黃活性成分作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。同時分析PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，以連接度(Degree)為指標(biāo)，連接度值越大，說明靶點連接越緊密，進(jìn)而說明靶點越重要。分析結(jié)果顯示，處于蒲黃活性成分作用靶點中心的蛋白，腫瘤壞死因子(TNF，度值=15)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA，度值=14)、轉(zhuǎn)錄因子(JUN，度值=14)、有絲分裂原激活蛋白激酶14 (MAPK14，度值=14)、蛋白激酶(AKT1，度值=13)、雌激素受體(ESR1，度值=10)等相互聯(lián)系較為緊密，揭示蒲黃的活血化瘀網(wǎng)絡(luò)中存在連線密度較高的子網(wǎng)(module)，子網(wǎng)由具有生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)復(fù)合體和功能

圖2 蒲黃活性成分作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

模塊組成[22]，同時表明TNF、VEGFA、JUN、MAPK14、AKT1、ESR1可能為蒲黃活性成分作用的關(guān)鍵靶點。上述蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞增殖和凋亡、血管內(nèi)皮生成、癌細(xì)胞生長的抑制、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的參與等方面。采用分子復(fù)合物檢測算法(MCODE)對相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到4個module，選取與蒲黃活血化瘀藥理相關(guān)的3個module (圖3)進(jìn)行描述，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些module主要涉及對脂多糖的應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和對細(xì)菌起源分子的應(yīng)答等生物過程(表3)。推測蒲黃活血化瘀作用可能與上述過程有關(guān)。

紅色表示module 1，藍(lán)色表示module 2，綠色表示module 3

表3 蒲黃活性成分作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)功能描述

2.5 疾病-靶點的網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

為了更直觀地觀察靶點和疾病的關(guān)系，構(gòu)建疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。將靶點分為7個特征病癥(這7個特征病癥與血瘀證對應(yīng)的4個模塊關(guān)聯(lián)):癌癥(Cancer)、血管疾病(Vascular diseases)、免疫系統(tǒng)疾病(Immune system diseases)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(Nervous system diseases)、炎癥(Imflammation)、疼痛(Pain)及其他疾病(Other diseases)，與傳統(tǒng)的血流動力學(xué)異常、凝血異常、炎癥反應(yīng)和腫瘤對應(yīng)。表明蒲黃治療血瘀證可能與7個方面的病癥相關(guān)。

圓形表示靶點，八邊形表示疾病

2.6 蒲黃活性成分作用靶點功能和通路的富集分析

通過Metascape平臺對蒲黃活性成分作用的83個靶點進(jìn)行通路富集分析，并使用在線平臺對前20條結(jié)果進(jìn)行可視化(圖5)。蒲黃治療血瘀證相關(guān)的生物過程主要有對脂多糖的應(yīng)答(Response to lipopolysaccharide)、對受傷的反應(yīng)(Response to wounding)和血液循環(huán)(Blood circulation)等(圖5a)。與血瘀證有關(guān)的通路有血管新生相關(guān)的VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)，IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)，NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等(圖5d)。與血瘀證有關(guān)的靶點功能主要體現(xiàn)在蛋白激酶(Protein kinase binding)、內(nèi)肽酶活性(Endopeptidase activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(Cytokine receptor binding)等方面(圖5c)。與血瘀證相關(guān)的細(xì)胞組分有細(xì)胞器外膜(Organelle outer membrane)、血漿脂蛋白顆粒(Plasma lipoprotein particle)、核膜(Nuclear envelope)等(圖5b)。表明蒲黃治療血瘀證可能與以上描述有關(guān)。

圖5 蒲黃活性成分作用靶點通路富集分析

2.7 蒲黃成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為系統(tǒng)地剖析蒲黃治療血瘀證的潛在機(jī)制，將83個蛋白質(zhì)靶點映射到前20條KEGG通路上(圖6)。結(jié)果顯示，VEGF信號通路富集靶點15個，IL-17信號通路富集靶點13個，NF-κB信號通路富集靶點13個，這3個通路與血瘀證關(guān)聯(lián)較緊密。這些富集多靶點的通路與血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、炎癥密切相關(guān)，通路富集的靶點信息見表4。

不同的顏色表示不同的類型，淺綠色為靶點，淺紫色為蒲黃活性成分，藍(lán)色為通路。圖形面積越大，表示該節(jié)點越重要

表4 主要通路富集的靶點信息

續(xù)表4

2.8 分子對接結(jié)果分析

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度值排前5的靶點，TNF、VEGFA、JUN、MAPK14和AKT1分別和16個與血瘀證相關(guān)的蒲黃活性成分、Aspirin進(jìn)行分子對接。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，受體和配體的結(jié)合能小于-7，表示兩者間具有較好的結(jié)合作用；結(jié)合能數(shù)值越低，產(chǎn)生相互作用所需的能量就越低[23]。圖7為16個化合物分別與5個核心靶點進(jìn)行對接的結(jié)合能。由圖7可知，結(jié)合能小于-7的有42種(49.41%)，位于-5與-7之間的有31種(36.47%)，在-1與-4.9之間的有12種(14.12%)。蒲黃成分異鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并吡喃-4-酮、兒茶素和表兒茶素等與受體結(jié)合可產(chǎn)生5個以上的氫鍵作用(圖8)，具有良好的活性。Aspirin與TNF的結(jié)合能最低為-6.6，與蒲黃活性成分相比稍差。結(jié)合能小于-5的表示結(jié)合活性良好[24]，占總數(shù)的85.88%。經(jīng)過分子對接驗證，說明蒲黃活性成分對治療血瘀證具有較好的活性。

顏色越紅，對應(yīng)的值越小，說明對接強(qiáng)度越大

圖8 蒲黃主要成分和靶點的對接結(jié)果

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，對血瘀證研究越來越深入，較古代判斷疾病的“問、聞、望、切”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)更多的是研究疾病的發(fā)病機(jī)制以及藥物對疾病的作用機(jī)制，并已經(jīng)發(fā)展到分子層面。由表1可知，蒲黃的活性成分有81.25%是黃酮類化合物。本課題組前期實驗表明，生蒲黃和蒲黃炒炭后黃酮類成分變化具有明顯差異，并與藥效的變化有關(guān)[25]，可推斷蒲黃總黃酮是重要的活性成分，與本文推斷的結(jié)果一致。

研究分析PPI網(wǎng)絡(luò)可知，VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14的連接度值在PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前6，說明蒲黃活性成分與這些靶點具有較高的結(jié)合活性。VEGFA是參與血管新生的相關(guān)因子，該因子可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，并與炎癥指標(biāo)、疾病活動及血管通透性呈正相關(guān)關(guān)系，參與固有的免疫調(diào)節(jié)[26]。AKT1在血管細(xì)胞中是以亞型存在，影響血管化反應(yīng)的多個調(diào)控途徑，包括抗血管生成、調(diào)節(jié)血管通透性、血管生成反應(yīng)和血管成熟[27]。靶點 ESR1調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)，促進(jìn)損傷血管功能的恢復(fù)，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起保護(hù)神經(jīng)的作用[28]。以上研究成果證實PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的靶點可能與血瘀證密切相關(guān)，其中VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14可能是治療血瘀證的關(guān)鍵靶點。

KEGG通路富集結(jié)果可知，在蒲黃治療血瘀證過程中涉及的通路可能與VEGF信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路有關(guān)。如NF-κB信號通路中的促炎因子、TNF-α、AngⅡ等多種刺激因子被誘導(dǎo)后，在下游調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素相關(guān)基因、凋亡抑制因子、編碼黏附因子相關(guān)基因等多種基因的表達(dá)，涉及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化及凋亡等，與Notch信號通路有關(guān)，與IKK激酶、IκB激酶的細(xì)胞內(nèi)信號有關(guān)。在炎癥中，TNF-α、IL-6、NF-κBP65等促炎細(xì)胞因子增加，NF-κB炎癥基因的表達(dá)增加。IL-17信號通路中的IL-17F、IL-25也具有促炎作用[29]。VEGF信號通路與下游信號聯(lián)級反應(yīng)，包括PI3K-Akt通路、p38-MAPK通路及Raf通路，進(jìn)而控制血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和遷移，促進(jìn)血管新生并提高血管通透性。血管生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，新生血管不僅為病變組織提供養(yǎng)分，保證其生長繁殖，而且使得腫瘤細(xì)胞與個體血液循環(huán)直接相通，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。上述結(jié)果表明，蒲黃治療血瘀證可能與VEGF信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路等有關(guān)。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的篩選，選取PPI網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)系緊密的VEGFA、AKT1、TNF、JUN、MAPK14 5個靶點，分別與蒲黃活性成分對接，進(jìn)一步驗證其結(jié)合活性，同時將陽性藥Aspirin與上述5個靶點進(jìn)行對接。可視化對接結(jié)果顯示,表兒茶素與VEGFA、異鼠李素-3-O-新橙皮苷與MAPK14、兒茶素與MAPK14的結(jié)合強(qiáng)度較好，Aspirin與5個靶點的結(jié)合強(qiáng)度較表兒茶素、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、兒茶素弱。Aspirin在治療血瘀證方面療效明確且顯著，而蒲黃活性成分的對接結(jié)果優(yōu)于陽性藥Aspirin，表明蒲黃在治療血瘀證方面具有極大的潛力，開發(fā)價值較大，后續(xù)可對其進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步揭示蒲黃多成分、多靶點、多通路的作用特點，發(fā)現(xiàn)蒲黃活性成分作用靶點可分為7個病癥，這7個特征病癥與血瘀證的4個模塊相關(guān)聯(lián)，預(yù)測蒲黃治療血瘀證的可能作用靶點和代謝通路；從分子對接結(jié)果來看，蒲黃活性成分異鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并吡喃-4-酮、兒茶素和表兒茶素等的對接效果均優(yōu)于陽性藥Aspirin。本研究粗略說明了蒲黃治療血瘀證的分子機(jī)制，不僅為蒲黃的活血化瘀作用提供了理論依據(jù)，為將來相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，而且為傳統(tǒng)中藥材作用機(jī)制的研究提供新的思路。