甘蔗中次生代謝產(chǎn)物和保護(hù)酶與螟蟲(chóng)抗性的相關(guān)性研究

王 輝，阿迪拉·阿迪力，楊乃博，熊 焰，伍蘇然*

(1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71001；2北京農(nóng)學(xué)院，北京100096)

0 引言

甘蔗(學(xué)名：Saccharum officinarum英文名：Sugarcane)是重要糖料作物，在我國(guó)廣西、云南、廣東、海南、福建、臺(tái)灣等地區(qū)廣泛種植。由于甘蔗種植面積大，宿根蔗可多年種植，從而導(dǎo)致蟲(chóng)害嚴(yán)重，而為害甘蔗最嚴(yán)重的是甘蔗螟蟲(chóng)。甘蔗螟蟲(chóng)主要包括條螟、大螟、二點(diǎn)螟、紅尾白螟和黃螟，在我國(guó)各蔗區(qū)均有發(fā)生，在甘蔗的整個(gè)生長(zhǎng)階段都嚴(yán)重危害甘蔗。受螟蟲(chóng)危害后的甘蔗平均產(chǎn)量損失10%～25%[1]，其糖分降低0.93%～3.5%[2]。

螟蟲(chóng)害防治方法有化學(xué)防治、生物防治和綜合防治法等[3]。化學(xué)防治多選擇使用殺蟲(chóng)劑，對(duì)人體和環(huán)境都有毒害，生物防治和綜合防治法雖然安全環(huán)保，但是防治效果比較緩慢。近年來(lái)，我國(guó)甘蔗螟蟲(chóng)普遍發(fā)生并造成嚴(yán)重危害，使防治甘蔗螟蟲(chóng)為害已成為當(dāng)前甘蔗生產(chǎn)上的一項(xiàng)重要工作。利用品種對(duì)害蟲(chóng)的不敏感性，對(duì)害蟲(chóng)種群實(shí)施控制，不但有利于害蟲(chóng)的防治，也有利于減少環(huán)境污染、維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡。利用甘蔗自身抗蟲(chóng)特性選育抗蟲(chóng)品種的甘蔗，是目前公認(rèn)最根本、經(jīng)濟(jì)效率高和對(duì)環(huán)境影響最少的辦法[4]。目前育種工作者已選育了許多甘蔗抗蟲(chóng)品種，對(duì)螟蟲(chóng)有不同程度的抵御能力，但是其抗蟲(chóng)機(jī)理尚未被闡明。

植物被昆蟲(chóng)取食后，植物體內(nèi)可產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，這些化合物對(duì)昆蟲(chóng)有毒或者可避免昆蟲(chóng)取食，以降低昆蟲(chóng)對(duì)植物的危害[5]。同時(shí)，當(dāng)植物受到蟲(chóng)害脅迫后也會(huì)激活各種保護(hù)酶或防御酶，如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、過(guò)氧化物酶(Peroxisome，POD)、多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)等，從而生成防御物質(zhì)，直接毒殺害蟲(chóng)，驅(qū)避害蟲(chóng)或招引其天敵，對(duì)植物進(jìn)行相應(yīng)的保護(hù)[6]。茉莉酸類(lèi)化合物(Jasmonates)是一種植物內(nèi)源生長(zhǎng)激素，用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝途徑和抵御害蟲(chóng)入侵[7]。研究表明：利用外源茉莉酸類(lèi)化合物同樣可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，與抵御病原微生物或蟲(chóng)害入侵產(chǎn)生同樣的效果[8]。

本研究利用茉莉酸甲酯對(duì)苗期不同品種甘蔗進(jìn)行處理，比較螟蟲(chóng)抗性/易感甘蔗品種體內(nèi)保護(hù)酶和次生代謝產(chǎn)物的差異，旨在為甘蔗的抗蟲(chóng)品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)前期對(duì)海南蔗區(qū)不同甘蔗種質(zhì)對(duì)螟蟲(chóng)抗性差異進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)粵甘34號(hào)、云蔗03-258和粵甘26號(hào)具有很好的螟蟲(chóng)抗性，而德蔗03-83號(hào)、粵甘 35號(hào)和柳城 03-1137則屬于螟蟲(chóng)易感品種，ROC22號(hào)對(duì)螟蟲(chóng)的抗性居中[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的甘蔗品種為螟蟲(chóng)抗性品種粵甘34號(hào)、云蔗03-258和粵甘 26號(hào)；螟蟲(chóng)易感品種德蔗 03-83、粵甘 35號(hào)和柳城03-1137；對(duì)螟蟲(chóng)的抗性介于抗性品種和易感品種之間的ROC22號(hào)，該品種目前在海南大規(guī)模種植。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將選取的甘蔗品種于2014年1月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所溫室內(nèi)進(jìn)行盆栽，生長(zhǎng)1個(gè)月后，即2月份甘蔗長(zhǎng)出5片葉子時(shí)，進(jìn)行茉莉酸甲酯處理。

茉莉酸甲酯處理：用可調(diào)式噴霧器均勻的將配制好的茉莉酸甲酯噴施在植株葉片上，有水珠掛在葉片上是最宜的噴施程度。在用完茉莉酸甲酯處理72 h后，測(cè)定各樣品的總酚、單寧的含量以及過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活性。分別把每個(gè)品種重復(fù)3次。

1.2.1 總酚含量的測(cè)定

(1)樣品的提?。悍Q(chēng)取甘蔗心葉以下第一片葉0.5 g，加入95%乙醇后將其研磨成勻漿，然后用濃度為95%的乙醇提取3次，轉(zhuǎn)入離心管中，以10000 r/ min的速度離心10 min，取上清液后定容至10 mL待測(cè)。

(2)總酚的測(cè)定[10]：將樣品溶液稀釋至100倍后取2 mL加入至試管，加入l mL Folin-Ciocalteu試劑，搖3 min搖勻后，加入2 mL 10%的Na2CO3溶液，靜置1 h后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在670 nm處的OD值。用鄰苯二酚配置標(biāo)準(zhǔn)液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 單寧含量的測(cè)定

(1)樣品的提?。悍Q(chēng)取1 g葉片，在冰浴中加蒸餾水研磨成勻漿，連同殘?jiān)D(zhuǎn)入離心管中，用蒸餾水提取3次后以1000 r/min的速度離心10 min，取上清液定容至10 mL，在20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)單寧的測(cè)定：取1 mL待測(cè)液，加入50 μL福林酚顯色劑和 10% Na2CO3溶液 4 mL，靜置 30 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在760 nm處的OD值。

1.2.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)活力的測(cè)定

(1)酶液的提?。悍Q(chēng)取甘蔗新鮮葉片0.5 g，置研缽中，加少量石英砂，在4℃下預(yù)冷的pH 7.8磷酸緩沖液3 mL后研磨成勻漿，把研缽用緩沖液沖洗3次，定容至25 mL?；旌暇鶆蚝髮⑷芤阂迫?℃冰箱中靜置l0 min。吸取上清液在離心機(jī)中以4000 r/min的速度離心15 min，再次吸取上清液，得酶液，保存于4℃條件下備用。

(2)酶活力的測(cè)定：用10 mL試管取一定量的酶，在25℃條件下預(yù)熱后，加入0.3 mL 0.l mol/L的H2O2后立即計(jì)時(shí)，在紫外分光光度計(jì)240 nm下測(cè)定吸光度，每隔1 min讀數(shù)1次，計(jì)算酶活性。

1.2.4 多酚氧化酶(PPO)活力的測(cè)定

(1)酶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取新鮮葉片 1 g，剪碎后放入研缽，加入配制好的提取液(0.1 mol/L的pH 7.0的磷酸緩沖液內(nèi)含7% PVP和10% TritonX100)20 mL，與少量石英砂在冰浴條件下研磨成勻漿，再加入10 mL提取液，轉(zhuǎn)入離心管，于4℃左右8000 r/min離心5 min，取上清，得酶液，待測(cè)。

(2)酶活力的測(cè)定：取1 mL酶液，加入上述提取液2 mL，再加入苯二酚1 mL，混勻后立即用紫外分光光度計(jì)在405 nm處測(cè)定其吸光度，1 min后測(cè)第2次，記錄2次差值，以每分鐘變化0.01為1個(gè)酶活力單位，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 過(guò)氧化物酶(POD)活力的測(cè)定

(1)酶液的提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)量采集的甘蔗新鮮葉片0.l g，放入研缽中，加適量 0.2 mol/L的 pH 6.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，研磨成勻漿。將勻漿移入離心管，用適量磷酸緩沖液沖洗研缽，在低溫條件下以4000 r/min的速度離心15 min。取上清液，定容至10 mL。低溫下貯存?zhèn)溆谩?/p>

(2)酶活力的測(cè)定：過(guò)氧化物酶活力采用愈創(chuàng)木酚法。量取50 mL上述磷酸緩沖液于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28 μL，放在磁力攪拌器上攪拌，待愈創(chuàng)木酚完全溶解后加入19 μL30% H2O2，均勻混合。加入1 mL待測(cè)酶液于3 mL上述混合液中，迅速混勻后，倒入比色皿用分光光度計(jì)于470 nm處測(cè)定吸光度，每分鐘測(cè)定1次，過(guò)氧化物酶活性單位(U)以每分鐘測(cè)定值變化0.01作為1個(gè)表示，計(jì)算其酶活力。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測(cè)定

(1)酶液的提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取 0.5 g新鮮葉片，將其剪碎，加入4 m150 mmol/L pH 7.8的磷酸緩沖液和5 mLPVPP，冰浴研磨成勻漿后加入4 mL PBS溶液漂洗，轉(zhuǎn)入離心管，10000 r/min離心20 min，取上清液，棄殘?jiān)ㄈ葜?0 mL，得待測(cè)酶液。

(2)酶活力的測(cè)定：取試管若干支，2支試管為對(duì)照，按表1加樣，加樣時(shí)盡量避光。加樣后混勻，將一支對(duì)照試管置于暗處避光，作為校零對(duì)照管，其它試管在光照下反應(yīng)20 min后在560 nm處測(cè)吸光度，對(duì)酶活性進(jìn)行計(jì)算。

表1 測(cè)定SOD的反應(yīng)體系

2 結(jié)果與討論

2.1 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗品種總酚和單寧含量的比較

茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗品種總酚含量如圖1所示，抗螟蟲(chóng)甘蔗品種粵甘34號(hào)、云蔗03-258、粵甘26號(hào)的總酚含量無(wú)顯著差異，但均顯著高于ROC22號(hào)和易感螟蟲(chóng)品種德蔗 03-83、粵甘 35號(hào)、柳城03-1137。易感螟蟲(chóng)品種德蔗03-83、粵甘35號(hào)、柳城03-1137的總酚含量無(wú)顯著差異。ROC22號(hào)的總酚含量位于感、抗螟蟲(chóng)品種之間，且與其它品種總酚含量差異顯著?？梢?jiàn)甘蔗受到脅迫后的總酚含量與甘蔗品種的螟蟲(chóng)抗性有關(guān)，螟蟲(chóng)抗性越強(qiáng)，總酚含量越高。經(jīng)茉莉酸甲酯處理后粵甘 34號(hào)和云蔗03-258的單寧含量顯著高于其他甘蔗品種，粵甘26號(hào)與 ROC22號(hào)差異不顯著，顯著高于易感螟蟲(chóng)品種，ROC22號(hào)與德蔗03-83差異不顯著，顯著高于粵甘35號(hào)和柳城03-1137，如圖2所示。經(jīng)茉莉酸甲酯處理后甘蔗品種間差異性顯著，抗螟蟲(chóng)甘蔗品種的單寧含量均比易感螟蟲(chóng)品種的單寧含量高。

圖1 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗品種總酚含量的比較

圖2 甘蔗品種單寧含量的比較

植物中的許多次生代謝產(chǎn)物往往可以毒殺昆蟲(chóng)或者具有昆蟲(chóng)拒食活性，從而對(duì)植物自身起到保護(hù)作用，被昆蟲(chóng)取食后其次生代謝產(chǎn)物含量的高低也直接反應(yīng)了其抗蟲(chóng)性的高低。如不同苜蓿品種在豌豆蚜為害后，抗蟲(chóng)品種的總酚含量始終高于低抗品種和感蟲(chóng)品種[11]。棉花被尺蠖取食后，其體內(nèi)單寧、棉酚、槲皮素、蘆丁和氯原酸含量顯著增加[12]。本研究所選甘蔗品種在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后螟蟲(chóng)抗性品種中總酚和單寧的含量明顯高于螟蟲(chóng)易感品種，可見(jiàn)其抗蟲(chóng)性和其在蟲(chóng)害脅迫下次生代謝產(chǎn)物的生成有關(guān)。

2.2 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗品種中CAT活性的比較

經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的7個(gè)甘蔗品種CAT活力由高到低分別為粵甘34號(hào)、云蔗03-258、粵甘26號(hào)、ROC22號(hào)、德蔗 03-83、粵甘 35號(hào)和柳城03-1137，如圖3所示，且各個(gè)甘蔗品種間 CAT活力均有顯著差異。螟蟲(chóng)抗性甘蔗品種的CAT活性顯著高于螟蟲(chóng)易感品種。

圖3 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)CAT活性的比較

CAT能催化H2O2分解為H2O和O2，降低多余的活性氧對(duì)細(xì)胞的損害，是植物為防御外界不良環(huán)境而產(chǎn)生的保護(hù)酶。綠豆受到豆蚜脅迫后，抗、易感品種CAT活性分別上升236.515%和124.426%，存在極顯著差異[13]。不同苜蓿品種受到豌豆蚜脅迫后，其高抗品種的CAT 活性始終高于低抗品種和易感品種[11]。研究結(jié)果表明：CAT活性與甘蔗的抗螟蟲(chóng)活性呈正相關(guān)性，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

2.3 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗品種中PPO活性的比較

茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后各甘蔗品種PPO含量如圖4所示，甘蔗品種間PPO活性差異與感、抗螟蟲(chóng)害的嚴(yán)重程度基本一致，PPO活性越高，抗螟蟲(chóng)性越強(qiáng)?？姑x(chóng)品種粵甘34號(hào)、云蔗03-258、粵甘26號(hào)的PPO活性顯著高于 ROC22號(hào)以及易感螟蟲(chóng)品種德蔗 03-83、粵甘 35號(hào)、柳城 03-113；ROC22號(hào)的PPO活性顯著高于易感螟蟲(chóng)品種。

圖4 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)PPO活性的比較

PPO是與植物抗蟲(chóng)性物質(zhì)關(guān)系密切的酶類(lèi)物質(zhì)，可催化酚類(lèi)物質(zhì)氧化為醌，并將一些必需氨基酸烷基化，從而使醌類(lèi)物質(zhì)抑制蟲(chóng)害的消化系統(tǒng)，使其營(yíng)養(yǎng)失衡。害蟲(chóng)抗性作物在蟲(chóng)害脅迫后，其PPO活性的提高文獻(xiàn)多有報(bào)道，如抗煙粉虱的黃瓜品種在人工接種煙粉虱后，其 PPO的活性明顯高于對(duì)照[14]；綠豆受到豆蚜脅迫后，豆蚜抗性品種PPO提高了359.674%，而易感品種的PPO活性?xún)H僅提高了67.445%[13]。本研究結(jié)果也證實(shí)了在茉莉酸甲酯脅迫下抗螟蟲(chóng)品種的甘蔗PPO活性顯著高于易感螟蟲(chóng)品種，可見(jiàn)PPO活性可以為抗蟲(chóng)品種選育作參考。

2.4 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗品種中POD活性的比較

茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后POD含量如圖5所示，甘蔗品種間POD活性差異顯著?；浉?4號(hào)的POD活性顯著高于其它品種材料，POD活性由高到低依次為云蔗03-258、粵甘26號(hào)、ROC22號(hào)、德蔗03-83、粵甘35號(hào)和柳城03-1137；抗螟蟲(chóng)性品種的POD活性均顯著高于易感螟蟲(chóng)品種。

圖5 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)POD活性的比較

POD參與植物體內(nèi)木質(zhì)素的合成，其活性的增強(qiáng)可使得植物體內(nèi)木質(zhì)素積累，從而防止昆蟲(chóng)取食[15]已有文獻(xiàn)報(bào)道，圣女果受到B型煙粉虱脅迫后，抗蟲(chóng)品種體內(nèi)的 POD活性的升高明顯高于感蟲(chóng)品種[16]，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明POD活性是植物抗蟲(chóng)性的標(biāo)志之一。

2.5 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗品種中SOD的活性比較

茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的7個(gè)甘蔗品種材料SOD活性(見(jiàn)圖6)，粵甘34號(hào)的SOD活性顯著高于其他品種材料，其次是云蔗03-258和粵甘26號(hào)；ROC22號(hào)位于感、抗品種材料之間?？姑x(chóng)品種的SOD活性均高于易感螟蟲(chóng)品種德蔗03-83、粵甘35號(hào)、柳城03-1137。

圖6 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后不同甘蔗品種SOD活性的測(cè)定

SOD可將植物體內(nèi)的活性氧歧化，產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氧氣，為其它保護(hù)酶參與活性氧代謝提供底物，是活性氧代謝的第一步反應(yīng)[17]。所以SOD活性的提高對(duì)植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫(包括蟲(chóng)害)有重要作用。如北抗楊受蟲(chóng)害后，其木質(zhì)部的SOD活性高于未受蟲(chóng)害的木質(zhì)部[18]。馬鈴薯受到馬鈴薯塊莖蛾取食后，其葉片中SOD活性高于未受取食的葉片[19]。本研究中抗螟蟲(chóng)甘蔗品種的 SOD活性均高于易感螟蟲(chóng)品種，表明SOD活性可以作為螟蟲(chóng)抗性選育的指標(biāo)。

3 結(jié)論

經(jīng)外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，抗螟蟲(chóng)品種粵甘34號(hào)、云蔗03-258、粵甘26號(hào)的總酚和單寧含量以及幾種保護(hù)酶過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性均高于螟蟲(chóng)易感品種粵甘35號(hào)、德蔗03-83和柳城03-1137。茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后甘蔗中次生代謝產(chǎn)物含量與保護(hù)酶活性均與甘蔗螟蟲(chóng)抗性呈正相關(guān)，因此，可以作為評(píng)判甘蔗品種抗蟲(chóng)性的重要指標(biāo)。