王 娜，戴伶俐，烏云塔娜，鋼托亞，趙世華，達(dá)來(lái)寶力格

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.呼倫貝爾市新巴爾虎右旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 新巴爾虎右旗 021300）

近年來(lái)，我國(guó)出臺(tái)了許多畜牧業(yè)扶持政策，推動(dòng)畜牧業(yè)迅速發(fā)展，牛產(chǎn)業(yè)成為畜牧業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。犢牛群作為牛場(chǎng)的后備力量，其健康與否直接影響牛場(chǎng)的整體經(jīng)濟(jì)效益。犢牛腹瀉是危害犢牛健康生長(zhǎng)的最常見(jiàn)疾病。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)大部分省份的規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)幾乎都有犢牛腹瀉發(fā)生，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成經(jīng)濟(jì)損失。

大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的主要病原，1～3日齡犢牛易感，發(fā)病初期常表現(xiàn)為腹瀉、脫水、生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重者可致死［1］。2015年新疆4個(gè)地區(qū)6個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)有千余頭犢牛因腹瀉死亡，發(fā)病率高于40%，死亡率高于50%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病原菌為大腸桿菌，大多數(shù)菌株攜帶鞭毛及腸毒素基因［2］；2017年1月新疆博樂(lè)牛場(chǎng)的30日齡以內(nèi)的犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，該牛場(chǎng)犢牛腹瀉的發(fā)病率為73%，死亡率為35%，并從新鮮的糞便樣品中分離到6株大腸桿菌，1株大腸桿菌（XJ-B1）可使小鼠產(chǎn)生腹瀉及死亡癥狀，且XJ-B1為多重耐藥菌［3］；2017年9月黑龍江某牛場(chǎng)2～14日齡犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率為5%，死亡率為100%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷該病原為大腸桿菌和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌［4］；2018年河北某牛場(chǎng)犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)該病原為大腸桿菌［5］；2019年內(nèi)蒙古通遼市某牛場(chǎng)出現(xiàn)犢牛腹瀉病，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確定病原為大腸桿菌，血清型為O17，且為多重耐藥菌［6］；2019年贛西某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)的犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率為60%，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷確定該病原為大腸桿菌，該菌對(duì)環(huán)丙沙星較敏感，治療后數(shù)日無(wú)新增病例［7］。

該研究從腹瀉犢牛的肛拭子中分離到2株大腸桿菌，并對(duì)分離菌進(jìn)行了鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，為后期的群體治療提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1病料在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣某養(yǎng)殖場(chǎng)采集2頭腹瀉犢牛的肛拭子樣品2份，裝入采樣袋，依次編號(hào)為XM-GSZ-1、XM-GSZ-2，低溫保存。

1.1.2主要試劑伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱有限責(zé)任公司；35種藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物有限責(zé)任公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重為25 g健康昆明小鼠18只，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.4主要儀器生化培養(yǎng)箱SPX-16B購(gòu)自吉林省安可有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋SH-WB-6GDN3購(gòu)自韓國(guó)三興有限責(zé)任公司；恒溫?fù)u床TS-2112B購(gòu)自上海比朗儀器制造有限責(zé)任公司；渦旋振蕩器VM-10購(gòu)自大韓科學(xué)有限公司；PCR儀ABI9902購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)有限責(zé)任公司；電泳儀HE99X購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)有限責(zé)任公司；全自動(dòng)凝膠成像儀購(gòu)自Type T2A美國(guó)伯樂(lè)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)在無(wú)菌條件下將肛拭子分別接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16～24 h，觀察菌落形態(tài)、顏色及菌體形態(tài)。將革蘭陰性桿菌菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～24 h，取1 mL菌液提取基因組，剩余菌液保種。

1.2.2菌株鑒定

1.2.2.1表型鑒定大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上為圓形紫黑色大菌落，表面光滑濕潤(rùn)，并有典型的金屬光澤；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為圓形微紅色菌落，中心為桃紅色，周圍呈渾濁圈，表面光滑整齊。

1.2.2.2生理生化鑒定通過(guò)硝酸鹽還原試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)及糖發(fā)酵等試驗(yàn)進(jìn)行大腸桿菌生理生化鑒定［8］。

1.2.2.316Sr DNA鑒定使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌DNA，-20℃保存。參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物27F和1492R［9］，送至上海生工生物有限責(zé)任公司合成。以27F和1492R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃，5 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，90 s，30次循環(huán)；72℃，7 min。PCR產(chǎn)物送到上海生工生物有限責(zé)任公司測(cè)序。使用NCBI或EBI比對(duì)序列，利用軟件MegAlign構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3大腸桿菌分型鑒定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.6—2016）［10］設(shè)計(jì)大腸桿菌分型引物。

1.2.4小鼠毒力測(cè)定挑取純化菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16～18 h，12 000 r/min離心2 min，棄上清，用0.85%的生理鹽水洗菌3次，并將菌濃度調(diào)至5×108CFU/mL，腹腔注射200 μL/只。每組6只小鼠，雌、雄各半，觀察1周。

1.2.5藥敏試驗(yàn)使用35種藥敏片進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，每種藥敏片設(shè)置3個(gè)重復(fù)，參考CLSI（2009）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)特性

該試驗(yàn)從2份肛拭子中分離到2株大腸桿菌（XM-GSZ-1、XM-GSZ-2），這2株菌株在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上為圓形紫黑色大菌落（見(jiàn)圖1A和圖1B），直徑1～2 mm，表面光滑濕潤(rùn)，并有典型的金屬光澤；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形微紅色菌落（見(jiàn)圖1C和圖1D），中心為桃紅色，周圍呈渾濁圈，直徑2～4 mm，表面光滑整齊。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)

2.2 菌株鑒定

2.2.1菌株生理生化鑒定菌株生理生化鑒定嚴(yán)格按照細(xì)菌新型生化鑒定管使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。由表1可知，這2株菌MR試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性，VP試驗(yàn)、苯丙氨基酸羧酶試驗(yàn)為陰性，且具有運(yùn)動(dòng)性，參照伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)，這2株菌符合大腸桿菌的理化特性，初步判定為大腸桿菌。

表1 菌株生理生化鑒定

2.2.2菌株16Sr DNA鑒定以菌株XM-GSZ-1和XM-GSZ-2基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1 500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（見(jiàn)圖2），經(jīng)上海生工生物有限責(zé)任公司測(cè)序，通過(guò)NCBI比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖3）及進(jìn)行同源性分析（見(jiàn)圖4）。同源性分析可知，分離株XM-GSZ-1與MT649857.1 Escherichia coli stain的相似度為99.2%，與MN094119.1 Escherichia coli strain的相似度為98.4%；XM-GSZ-2與MN094119.1 Escherichia coli strain的相似度為100%，與MT649857.1 Escherichia coli strain的相似度達(dá)到99.1%，因此，鑒定這2株菌株為大腸桿菌，且分離的這2株大腸桿菌的同源性為98.1%。

圖2 菌株P(guān)CR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 菌株序列同源性分析

2.2.3菌株大腸桿菌分型引物鑒定由圖5可知2株大腸桿菌均含有It基因和stp基因，依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.6—2016）［10］，確定該2株腹瀉大腸桿菌為ETEC型（產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌）。

圖5 菌株ETEC分型引物擴(kuò)增電泳圖

2.3 小鼠毒力鑒定

攻毒后12 h，小鼠精神呆滯，被毛粗亂，呼吸困難。菌株XM-GSZ-1試驗(yàn)組在攻毒后14 h有2只小鼠出現(xiàn)死亡，菌株XM-GSZ-2試驗(yàn)組在攻毒后12 h有2只小鼠死亡，72 h內(nèi)12只小鼠全部死亡，對(duì)照小鼠未出現(xiàn)任何臨床癥狀，因此，判定這2株大腸桿菌為強(qiáng)毒株。

2.4 體外藥敏試驗(yàn)

體外藥敏試驗(yàn)顯示（見(jiàn)表2），這2株菌對(duì)氨芐西林、氨曲南、頭孢唑啉、四環(huán)素、氧氟沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明等21種藥物表現(xiàn)為耐藥；對(duì)頭孢哌酮、頭孢曲松、克林霉素、多黏菌素B、米諾環(huán)素等10種藥物表現(xiàn)為中度敏感；對(duì)頭孢西丁、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星及呋喃妥因4種藥物表現(xiàn)為敏感。

表2 分離菌株體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

3 討論

該試驗(yàn)通過(guò)菌株分離培養(yǎng)、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)確定該菌為大腸桿菌。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.6—2016）［10］確定分離菌株為產(chǎn)腸毒素致病性大腸桿（ETEC）。ETEC是一種常見(jiàn)的引起人畜腹瀉的致病性大腸桿菌，且是養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉的最常見(jiàn)病原菌［12］。研究發(fā)現(xiàn)，ETEC主要依靠菌毛定殖于腸道黏膜，然后經(jīng)腸毒素的作用，使腸道產(chǎn)生炎癥損傷，宏觀癥狀為腸黏膜完整性被破壞，微觀癥狀為腸黏膜上皮細(xì)胞脫落、白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞明顯增加，從而引發(fā)犢牛腹瀉脫水，對(duì)犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育造成不利影響，嚴(yán)重者可致死［13-14］。另外，也有研究表明ETEC感染幼畜的嚴(yán)重程度常取決于日齡、自身狀況、生活及飲食環(huán)境等，食物傳播是主要的傳播途徑，犢牛因誤食污染的草料、水等引發(fā)感染［15］。有研究表明，新生犢牛出生12 h內(nèi)，推遲攝取初乳，會(huì)減少IgG在機(jī)體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移，能延遲腸內(nèi)細(xì)菌的定植，使?fàn)倥嗄糖懊馐苤虏【腥荆?6］。

考慮養(yǎng)殖場(chǎng)濫用抗生素的實(shí)際情況，細(xì)菌極可能產(chǎn)生耐藥性，所以該試驗(yàn)設(shè)計(jì)體外藥敏試驗(yàn)。分離菌株對(duì)21種藥物表現(xiàn)為耐藥性，對(duì)頭孢西丁、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星及呋喃妥因4種藥物表現(xiàn)為敏感，臨床治療過(guò)程中，使用環(huán)丙沙星能獲得較好的效果。