抗病毒口服液防治甲型流感病毒感染的藥效學(xué)研究*

毛 鑫，姚榮妹，包 蕾，高英杰，鮑巖巖，孫 靜，郭姍姍，時宇靜，崔曉蘭

中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700

抗病毒口服液收錄于《中華人民共和國藥典》一部，處方中包含板藍(lán)根、連翹、石膏和蘆根等九味中藥，臨床常用于治療風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱、上呼吸道感染、流感等疾?。?-2］。目前抗病毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及臨床應(yīng)用研究資料較為豐富［3-4］，但藥物防治病毒感染方面的基礎(chǔ)研究主要集中在體外抗病毒作用方面［5-6］。前期研究［7］表明，抗病毒口服液對甲型H1N1流感有明顯的治療作用，可抑制炎性反應(yīng)并抑制病毒增殖。本次實驗在此基礎(chǔ)上，擬通過建立甲型流感病毒體內(nèi)致小鼠肺炎模型、體外急性/慢性炎癥和甲型流感致細(xì)胞病變模型，對抗病毒口服液防治甲型流感病毒感染作用進(jìn)行進(jìn)一步的評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物病毒感染實驗ICR小鼠（SPF/VAF級）190只，體質(zhì)量（14±1）g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)條件：中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2生物安全動物房。

1.2 實驗材料MDCK犬腎細(xì)胞（北納生物，本研究室傳代液氮保存）；甲型H1N1流感病毒FM1株、PR8株、2007株、2009株、天津津南株及H3N2病毒（中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所及美國ATCC，由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2生物安全實驗室傳代，-80℃保存?zhèn)溆茫?；抗病毒口服液（杭州華潤老桐君藥業(yè)有限公司，批號：20170217）；雙黃連口服液（哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司，批號：16111732）；利巴韋林顆粒（四川百利藥業(yè)有限公司，批號：160622）。

1.3 試劑與儀器乙醚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20150417）；生理鹽水（華潤雙鶴藥液股份有限公司，批號：Y1609211W）；RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，青-鏈霉素雙抗，0.25%胰酶（美國，PBS緩沖液（均購自美國Gibco公司，批號：8117044，1527494，1796440，1798279，1789842）。A2型生物安全柜（美國Thermo公司）；YP1002型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；5810R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Enspire型多功能酶標(biāo)儀（德國PerkinElmer公司）；CKX31型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 劑量設(shè)計抗病毒口服液：藥物濃度折合生藥量4.3 g/10 mL，成人用量每次10 mL，每日2～3次，小鼠每日用量4.0、2.0和1.0 g/kg，相當(dāng)于臨床用量2倍量、1倍量和1/2倍量。雙黃連口服液：藥物濃度折合生藥量15.0 g/10 mL，成人用量每次20 mL，每日3次，小鼠每日用量16.5 g/kg，相當(dāng)于臨床用量1倍。利巴韋林顆粒：成人用量每次150 mg，每日3次，小鼠每日用量82.5 mg/kg，相當(dāng)于臨床用量1倍。所配藥物按小鼠20 mL/kg給藥，每日給藥1次。

1.4.2 體內(nèi)實驗

1.4.2.1 對甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株致小鼠肺炎模型的預(yù)防作用取小鼠70只，按體質(zhì)量等級隨機(jī)分為正常組，模型組，利巴韋林組，雙黃連組，抗病毒口服液2倍量、1倍量、1/2倍量組，每組10只。各給藥組按20 mL/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)4天，正常組和模型組在同等情況下給予蒸餾水。第4天灌胃后1 h，除正常組外，其余各組小鼠用乙醚輕度麻醉，分別以甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株滴鼻感染，每只35 μL。于感染后第4天稱質(zhì)量后處死，解剖取肺組織，稱重，計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。

肺指數(shù)（%）=肺濕重（g）/體質(zhì)量（g）×100%

肺指數(shù)抑制率（%）=（模型組肺指數(shù)-給藥組肺指數(shù)）/（模型組肺指數(shù)-正常組肺指數(shù)）×100%

1.4.2.2 對甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株致小鼠肺炎模型的死亡保護(hù)作用取小鼠120只，按體質(zhì)量等級隨機(jī)分為模型組、利巴韋林組、雙黃連組、抗病毒口服液2倍量、1倍量、1/2倍量組，每組20只。各組小鼠用乙醚輕度麻醉，分別以甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株滴鼻感染，每只35 μL。感染當(dāng)天各給藥組按20 mL/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)4天，模型組在同等情況下給予蒸餾水。觀察感染后2周內(nèi)動物的死亡情況，計算死亡率、死亡保護(hù)率、平均存活天數(shù)和生命延長率。

死亡保護(hù)率（%）=（模型組死亡率-給藥組死亡率）/模型組死亡率×100%

生命延長率（%）=（給藥組存活天數(shù)-模型組存活天數(shù)）/模型組存活天數(shù)×100%

1.4.3 體外實驗

1.4.3.1 對MDCK細(xì)胞的毒性試驗試驗前將抗病毒口服液用含2%胎牛血清的RIPM-1640培養(yǎng)基做1∶2-1∶256倍比稀釋備用，取已長成單層的MDCK細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)基，加入稀釋好的藥液，每個稀釋度藥液做4個復(fù)孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后于倒置顯微鏡下采用CEP法觀察細(xì)胞病變情況［6］，按Reed-Muench法計算半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（median toxic concentration，TC50）和 最 大 無 毒 濃 度（maximal atoxic concentration，TC0）。

1.4.3.2 對甲型流感病毒致MDCK細(xì)胞病變的治療作用試驗前取甲型H1N1流感病毒FM1株、PR8株、2007株、2009株、天津津南株及H3N2病毒用含2%胎牛血清的RIPM-1640培養(yǎng)基稀釋備用；將抗病毒口服液用含2%胎牛血清的RIPM-1640培養(yǎng)基做最大無毒濃度下5個稀釋度備用。取已長成單層的MDCK細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)基，加入稀釋好的病毒液，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入稀釋好的藥液，每個稀釋度藥液做4個復(fù)孔，正常組和模型組加入含2%胎牛血清的RIPM-1640培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）和治療指數(shù)（therapeutic index，TI）。

治療指數(shù)TI=TC50/IC50

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法選擇SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實驗

2.1.1 預(yù)防作用流感病毒FM1株和PR8株感染小鼠后，小鼠肺指數(shù)較正常組均明顯升高（P＜0.05）。感染前給予抗病毒口服液治療4天，抗病毒口服液3個劑量對于流感病毒FM1株感染所致小鼠肺指數(shù)升高均有顯著的抑制作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；抗病毒口服液1/2倍量組對流感病毒PR8株感染所致小鼠肺指數(shù)升高具有明顯的降低作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組流感病毒FM1株、PR8株感染小鼠肺指數(shù)抑制率比較

2.1.2 對動物死亡的保護(hù)作用流感病毒FM1株感染小鼠2周內(nèi)，小鼠死亡率為90%，平均存活天數(shù)為8.45天?？共《究诜航o藥4天后，小鼠死亡率均有所降低，但降低作用不明顯；小鼠的平均存活天數(shù)均有延長，其中抗病毒口服液1倍量和1/2倍量組的存活天數(shù)與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。流感病毒PR8株感染小鼠2周內(nèi)，小鼠死亡率為100%，平均存活天數(shù)為7.25天?？共《究诜航o藥4天后，小鼠死亡率均有所降低，其中抗病毒口服液1倍量和1/2倍量組的死亡率與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；小鼠的平均存活天數(shù)均有一定程度延長，但延長作用不明顯，見表3。

表2 各組流感病毒FM1株感染小鼠的死亡保護(hù)作用比較

表3 各組流感病毒PR8株感染小鼠的死亡保護(hù)作用比較

2.2 體外實驗

2.2.1 對MDCK細(xì)胞的毒性試驗抗病毒口服液對MDCK細(xì)胞的TC50為356 mg/mL，最大無毒濃度TC0為250 mg/mL。

2.2.2 對MDCK細(xì)胞病變的治療作用抗病毒口服液對甲型H1N1流感病毒FM1株、PR8株、2007株、2009株、天津津南株及甲型H3N2流感病毒致MDCK細(xì)胞病變均有明顯的抑制作用，半數(shù)抑制濃度IC50為44～100 mg/mL，治療指數(shù)TI為3.56～8.09。見表4。

表4 抗病毒口服液體對病毒致MDCK細(xì)胞病變的治療作用

3 討論

病毒在體內(nèi)的繁殖主要分為黏附、入侵、復(fù)制及釋放四個過程，而從病毒入侵機(jī)體到引起肺炎甚至機(jī)體死亡的過程主要由炎性反應(yīng)及氧化損傷等多方面因素導(dǎo)致，因此目前抗病毒藥物作用靶點(diǎn)主要集中在抑制病毒黏附入侵、抑制病毒復(fù)制、抑制病毒釋放以及抑制機(jī)體過度免疫反應(yīng)四個方面［8］。

目前中藥抗病毒機(jī)制研究對以上四個靶點(diǎn)均有涉及：梔子可抑制病毒入侵環(huán)節(jié)，黃芩苷可抑制病毒RNA聚合酶活性，板藍(lán)根可抑制神經(jīng)氨酸酶從而抑制病毒的釋放環(huán)節(jié)，而大多數(shù)中藥都表現(xiàn)出抗炎活性［9-12］。

利巴韋林及雙黃連常被用于治療流感，故選擇這兩種藥做為陽性對照藥物以評價抗病毒口服液抗流感作用的可行性?？共《究诜侯A(yù)防給藥4天可顯著降低流感病毒感染所致動物肺指數(shù)升高，給藥4天后對流感病毒感染所致動物死亡情況有明顯的改善作用，可顯著降低死亡率，增加存活天數(shù)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病毒口服液對于FM1和PR8兩株甲型流感病毒感染的作用特點(diǎn)有所不同：抗病毒口服液的預(yù)防作用對FM1株感染所致肺炎模型較為顯著；而其死亡保護(hù)作用對于FM1株感染主要體現(xiàn)在延長存活時間方面，對于PR8株感染主要體現(xiàn)在降低死亡率方面，而這種作用特點(diǎn)的不同可能是由于藥物作用機(jī)制的多樣性導(dǎo)致的。體外實驗表明，抗病毒口服液對多種甲型H1N1流感病毒所致的細(xì)胞病變有明顯的治療作用。

綜上所述，抗病毒口服液對于體內(nèi)外甲型流感病毒感染模型具有明顯的治療和預(yù)防作用。