熒光光譜法研究萘普生和殼聚糖之間的相互作用

孫杰，張冰衛(wèi)，徐光富，李博*（. 南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，南京 98；. 中國藥科大學藥學院，南京 0009；3. 中國藥科大學理學院，南京 98）

殼聚糖（chitosan）是氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖組成的多糖，它是天然糖類中唯一大量存在的堿性氨基多糖[1-2]。目前殼聚糖已經(jīng)被應用于食品、藥用輔料、生物醫(yī)學材料等多個領域，在緩控釋制劑、生物醫(yī)學材料等方面扮演著越來越重要的角色[3-6]。

萘普生（naproxen）是非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥，通過抑制前列腺素合成而起到抗炎鎮(zhèn)痛作用[7]。近年來已有利用殼聚糖等對萘普生進行包封[8-9]，開發(fā)緩控釋制劑等的報道，以改善萘普生的吸收及降低其不良反應。在制劑中，輔料與藥物之間可能通過靜電力、范德華力、疏水性作用力、氫鍵作用力等形成包合物、共晶、分散體、復合物等，因此在藥物制劑研發(fā)過程中，對藥物與輔料間相互作用的考察不可缺少[10]。熱分析法、紅外光譜法、X 衍射法等是常用的藥物與輔料相互作用研究方法[11]。

熒光光譜法常用于蛋白質(zhì)和小分子之間相互作用的研究，利用小分子對蛋白質(zhì)熒光猝滅，通過Stem-Volmer 方程計算熒光猝滅常數(shù)Ksv，并計算結合常數(shù)和結合位點數(shù)以及相應的熱力學參數(shù)ΔS 和ΔG，研究結合常數(shù)和作用力類型[12]。課題組前期對大分子猝滅劑與小分子熒光物之間的相互作用模型進行了完善，比較了小分子熒光藥物與大分子之間相互作用研究模型[13]。本文利用熒光光譜法研究萘普生和殼聚糖之間相互作用的結合常數(shù)，推測殼聚糖與萘普生作用的基本原理，從而為殼聚糖與藥物的相互作用的研究和應用提供理論基礎，也為殼聚糖作為輔料的應用提供基礎。

1 材料

F4600 熒光分光光度計（日本日立）；2004-21 智能型超級恒溫水槽（常州國華電器有限公司）；pH 計（pHS-3B，上海儀電科學儀器股份有限公司）。萘普生（含量：99.9%，批號：100198-201004，中國食品藥品檢定研究院），殼聚糖（4 ～296 kD，中國藥科大學藥劑教研室；410 kD，江南大學），其他試劑為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 萘普生溶液（NPS） 稱取10 mg 萘普生于10 mL 的量瓶中，甲醇溶解并定容，得萘溶液濃度為1.74×10－4mol·L－1的NPS 溶液，于4℃保存。

2.1.2 殼聚糖溶液（CTS） 稱取0.25 mg 殼聚糖于25 mL 量瓶中，水溶解并定容，得濃度為2.44×10－7mol·L－1的CTS 溶液，于4℃保存。

2.1.3 Britton-Robinson（BR）緩沖液 取0.04 mol·L－1的磷酸、乙酸、硼酸混合酸液，用0.2 mol·L－1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至5。

2.2 激發(fā)波長和發(fā)射波長的確定

移取0.1 mL 的NPS 溶液于5 mL 量瓶中，加1.5 mL BR 緩沖液，用水定容，置1 cm×1 cm 的石英比色皿中，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，確定最大激發(fā)波長（262 nm）和發(fā)射波長[（355±0.5）nm]。熒光激發(fā)和發(fā)射波長狹縫寬度皆為5 nm，掃描速度為1200 nm·min－1，掃描電壓為400 V。

2.3 熒光光譜分析

在5 mL 量瓶中，依次加入0.1 mL NPS 溶液、1.5 mL BR 緩沖液，用水定容，搖勻，298 K（25℃）恒溫水浴10 min，固定激發(fā)波長262 nm，在250 ～ 450 nm 掃描NPS 的熒光光譜圖。

在5 mL 量瓶中，依次加入0.1 mL NPS 溶液、1.5 mL BR 緩沖液和不同體積的CTS 溶液，用水定容，搖勻，配制系列NPS 和CTS 混合溶液。將該混合溶液置298 K（25℃）恒溫水浴10 min，固定激發(fā)波長262 nm，在250 ～450 nm 內(nèi)分別掃描復合物的熒光光譜圖，記錄各溶液的熒光強度。

2.4 結合常數(shù)測定

根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線（公式1），以NPS 溶液355 nm 處熒光強度為F0，NPS 和CTS 混合溶液的355 nm 處熒光強度為F，將CTS濃度[Q]對熒光猝滅與F0/F進行線性回歸，計算CTS 與NPS 的相互作用的結合常數(shù)Ka。

3 結果與討論

3.1 熒光光譜特征

如圖1 所示，NPS 的熒光發(fā)射波長和激發(fā)波長分別為355 nm 和262 nm。因此后續(xù)試驗中，分別以355 nm 和262 nm 為熒光發(fā)射波長和激發(fā)波長。

圖1 萘普生的熒光激發(fā)光譜圖和發(fā)射光譜圖Fig 1 Fluorescence excitation and emission spectrogram of NPS

3.2 體系pH 值對熒光猝滅的影響

分別在pH 4、5、6、7、8、9、10 的條件下測定NPS 溶液（1.74×10－4mol·L－1）、CTS 溶液（2.44×10－7mol·L－1）、NPS-CTS 結合物的熒光強度值。結果如圖2 所示，CTS 在各個pH值下熒光強度均很弱，與NPS 的熒光強度相比，可以忽略不計；NPS 的熒光強度隨著pH 值的變化沒有明顯的變化。

圖2 pH 值對熒光猝滅的影響Fig 2 Influence of pH on fluorescence quenching

當pH 值為5 時，NPS-CTS 的熒光強度最弱，此時pH 值條件下CTS 對NPS 的熒光猝滅程度最大，而對于NPS 和CTS 自身的熒光強度沒有明顯的影響。因此選擇與NPS 的pKa值相近的pH 5為測定的pH 值。由圖3 得出，在pH 5 時，NPS和CTS 相互作用的結合常數(shù)相對最大。

圖3 pH 值對結合常數(shù)的影響Fig 3 Influence of pH on binding constants

3.3 緩沖液的用量對熒光猝滅的影響

確定BR 緩沖液的pH 值為5.0，考察NPS、CTS、NPS-CTS 在不同用量緩沖液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）條件下熒光強度值的變化，結果發(fā)現(xiàn)緩沖液用量對熒光強度的影響不大，綜合選擇1.5 mL 作為試驗條件。

3.4 水浴時間的考察

確定緩沖液的pH 為5.0，用量為1.5 mL，取NPS 0.7 mL，加BR 緩沖液10.5 mL，加CTS 0.7 mL，用純凈水補足至35 mL，在25 ℃恒溫水浴中水浴加熱，于0 ～67 min 時間點取樣測定熒光強度，結果顯示在0 ～67 min 內(nèi)，體系猝滅程度基本不變，復合物在測定時間內(nèi)穩(wěn)定，綜合選擇水浴時間為10 min。

3.5 熒光猝滅類型

熒光猝滅分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種，動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞等導致的猝滅，而靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光分子在基態(tài)時生成不發(fā)光的復合物，從而導致熒光強度降低。在研究分子間相互作用，計算結合常數(shù)和結合位點數(shù)時，靜態(tài)猝滅是關鍵的前提條件。所以首先要對其猝滅類型進行判斷。試驗考察了不同溫度對NPS 和CTS 相互作用情況的影響。圖4 為NPS 在288、298 和303 K 與CTS 相互作用的Stem-Volmer（公式2）曲線圖，表1 為各溫度計算的Ksv。

圖4 不同溫度下NPS 與CTS 相互作用的Stem-Volmer 曲線圖Fig 4 Stem-Volmer curve of interaction between NPS and CTS

表1 不同溫度下CTS-NPS 的Ksv 常數(shù)Tab 1 Ksv of CTS-NPS at different temperatures

如圖4 和表1 所示，各溫度下Stem-Volmer曲線呈現(xiàn)良好的線性關系（r＞0.99），隨著溫度的升高，Stem-Volmer 曲線圖斜率下降，Ksv常數(shù)不斷變小，這是因為對于靜態(tài)猝滅在溫度升高時可能引起復合物的穩(wěn)定性下降，從而減小了靜態(tài)猝滅的程度，因此可以判斷本文研究猝滅屬于靜態(tài)猝滅。在實際操作過程中，為了避免溫度太高使得分子熱運動加劇從而導致體系在靜態(tài)猝滅的同時發(fā)生動態(tài)猝滅，同時為了試驗的易于進行，最終選擇298 K 作為試驗條件。

3.6 結合常數(shù)測定

取1.74×10－4mol·L－1NPS 溶液，加入不同濃度的CTS，加1.5 mL BR 緩沖液，用水定容到5 mL。激發(fā)波長262 nm，于200 ～500 nm 內(nèi)掃描得到萘普生的熒光猝滅光譜（見圖5）。

圖5 298 K 時不同濃度CTS 對萘普生的熒光猝滅光譜圖Fig 5 Fluorescence quenching of NPS with series concentration of CTS at 298 K

如圖5 的猝滅曲線所示，不同濃度CTS-NPS溶液的最大發(fā)射波長均為355 nm，表明CTS 能夠與NPS 發(fā)生相互作用進而猝滅NPS 的熒光。以355 nm 處的熒光強度，按Lineweaver-Burk 曲線進行線性回歸，得到圖6 的回歸曲線圖，以截距與斜率的比值計算Ka，得到CTS 與NPS 的結合常數(shù)Ka為8.29×105L·mol－1；按公式（3）對雙對數(shù)曲線進行線性回歸，得到圖7 的回歸曲線圖，其斜率為結合位點數(shù)n，得CTS 與NPS 的結合位點數(shù)為1.12，可見 CTS 與NPS 基本上是1∶1 結合的。

圖6 NPS 和CTS 相互作用的Lineweaver-Burk 曲線圖Fig 6 Lineweaver-Burk curve of NPS and CTS

圖7 NPS 和CTS 相互作用的雙對數(shù)曲線圖Fig 7 Double logarithmic curve of MET and CTS

3.7 作用力的推測

由不同溫度下的結合常數(shù)Ka， 通過Arrhenius 方程計算殼聚糖與萘普生相互作用的熱力學參數(shù)，結果見表2。

表2 殼聚糖與萘普生相互作用的熱力學參數(shù)Tab 2 Thermodynamic parameter of reaction between NPS and CTS

從表2 中可以看到，NPS 與CTS 相互作用的ΔH ＜0，ΔS ＞0。由于ΔS ＞0 可能是疏水和靜電作用力，ΔH ＜0 且較小時為靜電作用力，因此CTS 和NPS 之間的作用力主要為靜電作用力。又因為ΔS 對ΔG 的貢獻比ΔH 大，所以還含有疏水作用。表明作用力主要是CTS 的-NH3＋與NPS 的-COO－以靜電力結合，1∶1 作用形成分子量較大的復合物而使NPS 的熒光變?nèi)?。同時兩者反應的自由能ΔG ＜0，表明反應在正方向上是自發(fā)進行的。

3.8 殼聚糖分子量對相互作用的影響

分別考察了分子量為4、6、8、10、30、50、100、240、296、410 kD 的CTS 與NPS 的相互作用，結果如表3 所示，隨著殼聚糖分子量（MW）的逐漸增大，CTS 與NPS 的結合常數(shù)線性增大，回歸方程Ka＝2.165 MW－155.5，相關系數(shù)r為0.9900；同時結合仍為1∶1 結合。

表3 不同分子量殼聚糖與萘普生的相互作用Tab 3 Interaction of CTS with different weight and NPS

3.9 殼聚糖脫乙酰度對相互作用的影響

分別比較對脫乙酰度74.4%～88.8%的CTS與NPS 的相互作用，結果見表4。

表4 脫乙酰度對殼聚糖與萘普生相互作用的影響Tab 4 Effect of degree of deacetylation on the interaction of CTS and NPS

如表4 所示，CTS 的脫乙酰度（DD）對結合常數(shù)影響非常顯著，脫乙酰度與結合常數(shù)的回歸方程為Ka＝7.370×104DD－5.263×106，相關系數(shù)為0.9926。結合位點數(shù)除了脫乙酰度為82.9%的點其他沒有明顯改變，仍為1∶1 結合。在脫乙酰度為74.4%的較低的脫乙酰度的情況下，CTS對NPS 產(chǎn)生的熒光猝滅極弱，且隨著CTS 濃度的增加沒有呈現(xiàn)熒光猝滅增強的規(guī)律，說明當CTS的脫乙酰度較低，游離的-NH2數(shù)較少時，其與NPS 的作用很弱，導致NPS 的熒光沒有明顯的被猝滅現(xiàn)象，從也無法準確計算其結合常數(shù)和結合位點數(shù)；當CTS 的脫乙酰度逐漸增加時，游離的-NH2數(shù)逐漸增多，其與NPS 的相互作用增強，熒光猝滅現(xiàn)象明顯。由此可見，NPS 與CTS 的相互作用主要是靜電作用，CTS 的脫乙酰度對其與NPS 的相互作用影響較大，且CTS-NPS 結合的Ka值與脫乙酰度呈線性相關，相關系數(shù)r為0.9926。

4 結論

本文利用熒光光譜法證實NPS 與CTS 可發(fā)生相互作用，在pH 5.0、溫度298 K 時，兩者的結合比例為1∶1，結合常數(shù)為8.29×105L·mol－1；其相互作用以靜電作用為主。同時進一步發(fā)現(xiàn)CTS的分子量和脫乙酰度與其和NPS 的結合常數(shù)成正比，且脫乙酰度影響更為顯著，表明兩者的靜電作用通過CTS 的氨基發(fā)生；而結合比例基本不受CTS 的分子量和脫乙酰度影響。本研究為CTSNPS 等復合物的制備及CTS 作為藥物緩控釋材料的研究提供基礎。