D-甘露醇標準樣品的研制

晉文慧，陳偉珠，張怡評，方華，洪專，蔣聲鑄，巢志茂（. 自然資源部第三海洋研究所，自然資源部海洋生物資源開發(fā)利用工程技術創(chuàng)新中心，福建 廈門 36005；2. 廈門塔斯曼生物工程有限公司，福建 廈門 3602；3. 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 00700）

D-甘露醇（D-mannitol）為單糖，六元醇，為白色或無色結晶性粉末，無臭，具有清涼甜味，微澀，甜度約為蔗糖的70%，是海帶中重要的生物活性物質[1-7]。研究表明，甘露醇在體內不被代謝，具有脫水、利尿、降顱內壓及眼內壓的作用，可治療顱內高壓和青光眼[8-15]。臨床主要用于顱內壓增高癥的急救用藥，還用于腸道準備，脫水效果迅速、可靠、反跳小，并且具有鎮(zhèn)咳、平喘等作用。甘露醇毒副作用小，溶液性質穩(wěn)定，不參與體內代謝，治療眼部炎癥時不改變其通透性，是高滲脫水劑中的首選藥。甘露醇一般容易耐受，很快經腎臟排泄，可用于糖尿病患者。

甘露醇在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)中，具有廣闊的應用前景，常作為相關產品質量控制的重要指標性成分。目前市場上含D-甘露醇的產品及藥品均需要以D-甘露醇作為檢測標準，但目前，我國尚未研制出D-甘露醇國家標準樣品，相關企業(yè)、檢測機構、科研院所和醫(yī)院基本采用的是進口高純試劑，價格昂貴，且純度參差不齊，沒有進行過定值試驗，也沒有不確定度的數(shù)據評價，準確性、可比性、可溯源性均不能保證[16-18]。由于國內市場需求較大，因此，迫切需要開展D-甘露醇物質標準樣品的研發(fā)。本研究以海帶為原料，通過提取、濃縮、低溫析晶、反復重結晶、去除殘余溶劑等制備和純化過程，獲得高純D-甘露醇單體，按現(xiàn)行國家標準GB/T 15000.3-2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品：定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[19]要求，系統(tǒng)開展了標準樣品的研制工作，以提供獲得國家標準樣品證書的D-甘露醇國家標準樣品。

1 材料

1.1 儀器

400 MHz 型核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；LTQ Orbitrap Velos pro 質譜儀（美國Thermo公司）；Vario EL cube 元素分析儀（德國Elementar公司）；VERTEX 70 紅外光譜儀（德國Bruker 公司）；電感耦合等離子體質譜儀iCAP 7200（美國Thermo 公司）；Waters 高效液相色譜儀（e2695型），配蒸發(fā)光散射檢測器和工作站（美國Waters公司）；AL104 電子天平（瑞士Mettoler Toledo 公司）；SXJQ-120 型攪拌器、R-1001-VN 型旋轉蒸發(fā)器、MPC201Tp 型隔膜真空泵、DLSB-10/20 型低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長城科工貿有限公司）；馬弗爐SX2-4-10G（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；實驗室用水為重蒸水，乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；干燥的海帶（廈門農貿市場，產自漳州，由福建中醫(yī)藥大學黃鳴清教授鑒定為海帶Laminaria japonicaAresch 的葉狀體，樣品保存于自然資源部第三海洋研究所實驗室）。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 D-甘露醇粗提物的制備 稱取海帶干粉2 kg 放入反應釜中，加入90%乙醇80 L，在80℃加熱條件下，浸提1 h，上述操作重復3 次，合并提取液，在旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮，并進行低溫析晶，即得D-甘露醇粗提物。

2.1.2 D-甘露醇純化精制 將D-甘露醇粗提物加0.9 倍的水溶解后，加熱使其溶解，保持沸騰5 min 左右，放冷結晶。不斷攪拌，防止結塊，離心分離，得第一次重結晶物。加1.0 倍量的蒸餾水，0.1 倍量的活性炭，加熱使其溶解保持0.5 h，在90 ℃左右減壓過濾得濾液，冷卻結晶、離心，得結晶物。將此結晶物分別加0.7 倍、0.5 倍的水進行重結晶，方法同上。

將上述D-甘露醇用0.1 倍量以上的95%乙醇進行醇洗，離心甩干，最終獲得并收集白色高純晶體，經鑒定為D-甘露醇。

2.2 結構鑒定

2.2.1 元素分析 分子式為C6H14O6，理論值計算，按照C 原子12.0000，H 原子1.0078，理論值C [%] 39.54、H [%] 7.75，實際測定平均值C [%]39.63、H [%] 7.83。測定值與理論值相符。

2.2.2 旋光性分析 稱取甘露醇樣品，置于25 mL量瓶中，加入8 mL 鉬酸銨溶液（0.1 g·mL－1），再加入4 mL 硫酸溶液（0.5 mol·L－1），加水稀釋至刻度，搖勻，在25℃下測定。測得其比旋度[α]25D＝137.80，與數(shù)據庫中D-甘露醇的比旋度[α]25D＝137 ～145 一致，證明立體構型是D 型。

2.2.3 紅外光譜 通過KBr 壓片法測定紅外光譜。從結果可知，3400 cm－1為-OH 的伸縮振動，1421 cm－1為-CH2的變形振動，1289 cm－1為-CH2OH基團中-OH 的變形振動，1082 cm－1為-CHOH 基團中-OH 的變形振動，1018 cm－1為-CHOH 基團中C-O 的伸縮振動，630 cm－1為形成氫鍵的OH產生的變性振動。樣品的紅外光譜數(shù)據說明結構中存在-CH2、-OH、-CH2OH、-CHOH 等基團。

2.2.4 高分辨質譜 采用APCI 電離源（正離子模式），高分辨質譜測得的準分子離子峰m/z＝205.0689 [M ＋Na]＋，與對應的精確分子量205.0684（分子式C6H14O6）相符。

2.2.5 核磁共振波譜 以D2O 為溶劑，測定1H、13C、HSQC 的核磁共振數(shù)據，并對其進行歸屬。13C NMR 顯示3 個碳原子峰，位于δ63.14、69.15和70.72。通過HSQC 可以認為，δ63.14 的碳原子對應1H NMR 的δ3.74 （dd，J＝11.6，2.4 Hz，2H）和3.54 （dd，J＝11.6，6.0 Hz，2H）的4 個質子，應為1、6 位的2 個CH2，它們具有同樣的碳原子的化學位移，但是質子的耦合常數(shù)具有差異，說明1 位和6 位的質子各自相鄰的2 和5 位的CH 質子具有不等的立體環(huán)境。δ3.64 （ddd，J＝8.8，6.0，2.0 Hz，2H）既具有與J＝2.0 和6.0 Hz 耦合常數(shù)的1、6 位質子產生耦合，也有與3、4 位質子產生的耦合（J＝8.8 Hz），為2、5 位的2 個質子峰。δ3.67 （d，J＝8.8 Hz，2H）峰具有與2、5 位質子的耦合。通過HSQC 的對應關系得知，1、6 位CH2質子對應的碳原子為δ63.14，2、5 位CH 質子對應的碳原子為δ70.72，3、4位CH 質子對應的碳原子位于δ69.15。D-甘露醇核磁共振數(shù)據的解析結果與文獻[20]報道完全一致（見圖1）。

圖1 D-甘露醇結構式Fig 1 Structure of D-mannitol

2.3 D-甘露醇的純度分析

2.3.1 高效液相色譜蒸發(fā)光散射法 NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（Thermo Hypersil GOLD Amino），流動相：乙腈-水（70∶30，V/V），流速：1 mL·min－1；漂移管溫度：65℃，增益：50，氣體壓力：40 psi，進樣量：10 μL。精密稱取D-甘露醇1 mg，加1 mL 甲醇溶解，過0.22 μm 微孔濾膜，即得1 mg·mL－1的樣品溶液。采用峰面積歸一化法對D-甘露醇進行純度分析。該樣品除溶劑峰外，無明顯雜質峰出現(xiàn)，見圖2。

圖2 D-甘露醇的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of D-mannitol

2.3.2 離子色譜法 色譜柱：CarboPac PA10 （250 mm×4.0 mm，5 μm）（Thermo），流動相：H2ONaOH （250 mmol·L－1）（84∶16，V/V），流速：0.80 mL·min－1，柱溫：30℃。精密稱取D-甘露醇1 mg 置10 mL 量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，即得1 mg·mL－1的樣品溶液。采用離子色譜法對D-甘露醇進行純度分析。該樣品除溶劑峰外，僅單一洗脫峰，無明顯雜質峰出現(xiàn)，見圖3。

圖3 D-甘露醇的離子色譜圖Fig 3 Ion chromatography of D-mannitol

2.3.3 溶劑殘留的測定 按照《中國藥典》2020年版第四部[21]的方法，對D-甘露醇的殘留溶劑進行檢測，精確稱取D-甘露醇樣品約1.8 g，平行稱量樣品6 份，用水加熱溶解到10 mL 頂空瓶中，采用氣相色譜法測定，外標曲線法進行定量分析，以水為空白基質，平行測定6 次，均未檢測到甲醇、乙醇等提取過程中接觸的有機溶劑的殘留。

2.3.4 水分殘留的測定 采用卡爾費休法（Metrohm AG）進行6 次平行測定，結果水分殘留率為0.049%、0.050%、0.051%、0.049%、0.050%、0.051%，平均值為0.050%，RSD為0.018%。

2.3.5 灰分測定 通過高溫灼燒法，測得其灰分小于0.01%；通過質譜法測定Na、K、Ca、Mg、Fe 5 種金屬元素，結果Na、K、Ca、Mg、Fe 元素均低于檢測限。

2.4 均勻性檢驗

根據GB/T15000.3-2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品：定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[19]的指導，開展了標準樣品均勻性檢驗的研究工作。本批次D-甘露醇單體樣品共分裝200 瓶，每瓶5 mg，從1 號到200 號，通過在線隨機數(shù)生成器隨機挑選和重復測量的方法，本次抽樣數(shù)目為15個，采用單因素多水平試驗方差分析法進行純度的均勻性檢驗，按“2.3.1”項下方法測定，每個樣品重復測3 次。用峰面積歸一化法計算純度，然后用方差分析法進行均勻性檢驗。結果見表1 及表2。

表1 D-甘露醇標準品均勻性檢驗Tab 1 Homogeneity of certified reference material of D-mannitol

表2 D-甘露醇標準品均勻性試驗的方差分析Tab 2 Variance analysis of homogeneity test of certified reference material of D-mannitol

根據方差分析結果計算，統(tǒng)計量F＝MS組間/MS組內＝0.000 495/0.000 349 ＝1.42，通過查F界值表，F(xiàn)值小于F（0.05，14，30）的值2.04，說明在95%的置信區(qū)間，D-甘露醇樣品均勻性良好。

瓶間方差：SA2＝（MS組間－MS組內）/n＝（0.000 495－0.000 349）/3 ＝0.000 049

瓶間標準偏差：Sbb＝SA＝0.01%

均勻性實驗的不確定度（Ubb）等于瓶間標準偏差（Sbb），故Ubb＝Sbb＝0.01%。

2.5 穩(wěn)定性檢驗

2.5.1 長期穩(wěn)定性 取標準樣品的若干樣品瓶，按市售包裝樣式進行包裝，在2 ～4℃條件下放置24 個月，并分別于第0、6、12、18、24 個月隨機抽取3 個樣品瓶，在進行外觀性狀檢查后，按“2.3.1”項下方法配制樣品溶液并測定。每份樣品連續(xù)進樣兩次，然后用峰面積歸一化法求出其純度的平均值，結果見表3。根據檢測結果，D-甘露醇標準樣品具有24 個月的長期穩(wěn)定性。

表3 D-甘露醇標準樣品的純度穩(wěn)定性Tab 3 Stability of certified reference material of D-mannitol

根據導則[19]對穩(wěn)定性研究的要求，采用直線模型，對表3 中長期穩(wěn)定性試驗測得的純度數(shù)據進行分析。根據表3 所示檢測結果，斜率b1根據下式計算：

式中Xi為每次檢測時間（月數(shù)）；X＝12，為表3 中每次檢測間隔的時間總和月數(shù)與間隔檢測的次數(shù)之比；Yi為每次測得的純度（%）；Y＝99.85%，為表3 中5 次檢測純度的平均值。

截距b0由下式計算：b0＝Y－b1X＝99.852－（0.001 000×12）＝99.84%。

直線上的點的標準偏差可由下式計算：

取其平方根s＝0.031 198%，與斜率相關的不確定度用下式計算：

自由度為n－2 和P＝0.95（95%置信水平）的分布t因子等于3.182。由于|b1|＜t0.95，n-2×s（b1）＝3.182×0.001 644%＝0.005 231 6%，故斜率是不顯著的，說明未觀測到不穩(wěn)定性，表明D-甘露醇在24 個月實驗周期內穩(wěn)定性良好。

長期穩(wěn)定性試驗的不確定度（Ults）計算公式為Ults＝s（b1）×t（試驗時間月數(shù)）。將相應數(shù)據代入公式計算，得值為長期試驗穩(wěn)定性的不確定度貢獻度即為：

Ults＝Sb×t＝0.001 644%×24 ＝0.04%

以上直線模型分析結果表明，D-甘露醇標準樣品在低溫密閉環(huán)境下保存24 個月穩(wěn)定性良好。試驗結果說明，在實際保藏條件（溫度：2 ～4℃）下，D-甘露醇的穩(wěn)定期不低于2年。

2.5.2 短期穩(wěn)定性 將樣品模擬運輸條件，測定運輸條件下（25 ℃）樣品6 d 內的穩(wěn)定性。分別于0、2、4、6 d 進行檢測，采用峰面積歸一化法測定樣品配制后的穩(wěn)定性，樣品純度分別為99.86%、99.82%、99.87%、99.85%，RSD為0.022%，說明樣品在模擬運輸條件下6 d 內穩(wěn)定。

2.5.3 樣品溶液穩(wěn)定性 為考察樣品配制后，在多長時間內可以準確使用，考察樣品配制4 ℃放置7 d 的穩(wěn)定性。取本品1 mg，加1 mL 的甲醇溶解得1 mg·mL－1的樣品溶液，分別于0、0.5、1、2、4、7 d 檢測，采用峰面積歸一化法測定樣品配制后的穩(wěn)定性，樣品純度分別為99.86%、99.85%、99.87%、99.84%、99.85%、99.83%，RSD為0.014%，故樣品配制后7 d 內保持穩(wěn)定。

2.6 定值分析

根據導則[19]規(guī)定及實際條件，采用8 家實驗室協(xié)作試驗定值的方式進行D-甘露醇標準樣品的定值，每家分別隨機抽取2 瓶樣品送檢，每個樣品平行測試2 次，對8 家實驗室的6 個數(shù)據進行統(tǒng)計，按“2.3.1”項下色譜條件，每瓶重復測定3次，應用峰面積歸一化法進行定量[22]（見表4）。

表4 8 家實驗室D-甘露醇純度定值數(shù)據Tab 4 Certification data of D-mannitol in 8 laboratories

對所采集的測定結果，采用格拉布斯（Grubb’s）檢驗法進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值，測定結果呈正態(tài)分布。通過以上對檢驗數(shù)據的考察，所得數(shù)據符合導則[19]的要求。采用峰度法檢驗各實驗室數(shù)據的正態(tài)性，沒有檢出異常值。故各組所有數(shù)據全部有效，進行下一步統(tǒng)計，再用Grubb’s 法對每家實驗室的平均值進行檢驗，將其看成一組測定值進行異常值檢驗，實驗室間的Grubb’s 統(tǒng)計量G 均小于G'0.95（6）和G'0.99（6），因此將各家實驗室測得的數(shù)據作為無偏估計值，計算8 家測定結果的平均值及標準偏差。通過統(tǒng)計分析，總平均值為x＝99.86%。對表4 的數(shù)據進行方差分析，結果見表5。

表5 對8 家實驗室定值數(shù)據的方差分析結果Tab 5 Variance for purity test data by 8 laboratories

總和0.180 69847－

2.7 定值分析的不確定度評定

根據導則[19]規(guī)定，定值結果由特性值和不確定度組成。根據全部測定結果，計算D-甘露醇標準樣品的特性值和不確定度。

因未檢測到甲醇、乙醇等溶劑殘留，且Na、K、Ca、Mg、Fe 元素均低于檢測限，故由溶劑殘留及灰分引起的不確定度均可忽略不計。水分引起的不確定度包括儀器產生的不確定度和測量重復產生的不確定度。電子天平（最大稱樣量為32 g，精確度為0.01 mg），按照均勻分布，儀器產生的不確定度為U1＝0.01%，水分測量結果及總的不確定度為U水＝0.02%。

實驗數(shù)據經統(tǒng)計分析，確定了D-甘露醇標準樣品的實驗室內重復性標準偏差Sr為0.021%，復現(xiàn)性標準偏差SL為0.058%，綜合穩(wěn)定性檢驗不確定度，均勻性檢驗不確定度，定值檢驗不確定度，水分測定不確定度等實驗結果可得，D-甘露醇特性標準值為（1－0.02%）×99.86%＝99.84%。合成不確定度U＝0.06%，擴展不確定度U95＝kU＝2×0.06%＝0.12%（P＝95%，k＝2）。D-甘露醇標準樣品的純度為99.84%，置信度為95% 的擴展不確定度值為0.12%。

3 結論

本文建立了D-甘露醇的制備分離純化方法，制備所得的D-甘露醇標準樣品，根據標準樣品工作導則[19]的要求，按照研制流程對其進行了穩(wěn)定性、均勻性以及定值檢測研究，定值結果為99.84%，符合國家標準樣品的技術規(guī)范要求。所研制的D-甘露醇標準樣品填補了國內該領域研究的空白，不僅可用于D-甘露醇含量測定、檢測方法評定、相關產品的檢測與質量控制，對海帶等含有D-甘露醇的相關產品及藥品的檢測提供了標準樣品，也為檢測結果的準確性、可比性以及溯源性提供了技術支撐。