(陳二虎 侯秋莉

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室1，南京 210023)

(揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院2，揚州 225009)

表皮蛋白(CPs)是昆蟲表皮的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，與幾丁質(zhì)相互交聯(lián)形成復(fù)雜穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，以維持表皮彈性和其他物理性質(zhì)[1]。大量研究已經(jīng)證實CPs在昆蟲生長發(fā)育、表皮骨化、爬行能力、體型塑造、先天免疫、藥劑抗性等方面均發(fā)揮著重要的生理功能[2-6]。此外，CPs只存在于昆蟲等無脊椎動物中，且不同昆蟲間序列差異大，因此是開發(fā)高靶向性殺蟲劑的理想靶標。米象(Sitophilusoryzae)是當前世界范圍內(nèi)危害最為嚴重的儲糧害蟲之一，其日益突出的磷化氫抗性問題嚴重威脅糧食安全[7]。針對上述現(xiàn)狀，挖掘新的防效好、特異性強、安全性高的殺蟲靶標則顯得尤為亟需。

伴隨高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，迄今為止已從不同昆蟲的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定獲得大量CPs，包括赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)(151個)[8]、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)(175個)[9]、家蠶(Bombyxmori)(226個)[10]、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(174個)[11]、東亞飛蝗(Locustamigratoria)(81個)[12]、等。依據(jù)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，昆蟲CPs被劃分為10余個家族類群，包括CPR[13,14]、CPAP1(Cuticular Proteins Analogous to Peritrophin 1)[5]、CPAP3(Cuticular Proteins Analogous to Peritrophin 3)、CPLCA、CPLCG、CPLCP、CPLCW[15]、Tweedle、CPF[16,17]、CPFL、CPCFC、CPG[18,19]等。

鑒于昆蟲CPs數(shù)量眾多(約占昆蟲基因數(shù)量的1%)，而且不同昆蟲類群間表皮蛋白基因的數(shù)量和種類差異顯著，因此昆蟲CPs的鑒定、序列分析和家族分類是開展后續(xù)功能研究的重要前提。目前，雖然米象全基因組數(shù)據(jù)已公布，但是目前有關(guān)米象表皮蛋白的研究仍相對滯后，米象CPs的基因信息尚屬未知。因此，本研究擬基于米象基因組數(shù)據(jù)庫，開展CPs的鑒定、序列特征及其系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)果可為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)，進而為米象的防治提供新的思路和方法，具有重要的理論和應(yīng)用參考價值。

1 材料與方法

1.1 昆蟲基因信息數(shù)據(jù)來源

米象基因組數(shù)據(jù)源于National Center for Biotechnology Information(NCBI)公共數(shù)據(jù)庫(NCBI Assembly: GCF_002938485.1)。其他昆蟲CP基因信息均從NCBI的GnenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者VectorBase數(shù)據(jù)庫(https://www.vectorbase.org/)下載。

1.2 米象表皮蛋白基因的全基因組鑒定

基于米象基因組數(shù)據(jù)信息，通過同源序列比對方法鑒定獲得米象CPs序列(E-value < 1×10-5)。CPR家族以擴展保守基序R&R(pfam00379)作為參考序列進行BLASTP比對[20, 21]，運用CuticleDB網(wǎng)站http://bioInformatics2.biol.uoa.gr/CuticleDB/index.jsp將CPR家族基因劃分為RR-1和RR-2亞家族[11]；關(guān)于CPAP家族，基于GenBank數(shù)據(jù)庫下載的赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲CPAP1和CPAP3序列，通過與米象基因組比對鑒定得到相應(yīng)CP家族基因[22]；基于昆蟲保守的Tweedle基序(PF03103)識別米象同源的Tweedle家族[3]；通過與黑腹果蠅同源序列比對獲得米象CPLCG和CPLCP家族序列[15]；以CPF家族蛋白特征序列中最保守部分(VSxYSKAVDTPFSSVRKxDxRIVNxA)鑒定獲得米象CPF家族基因[17]；利用赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲CPs序列，經(jīng)同源比對獲得米象CPFL家族基因序列[9]；依據(jù)保守YPAGVNPAACPNYPYCD基序識別米象CPCFC家族[19]。

1.3 信號肽及保守結(jié)構(gòu)域分析

使用SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)[23]預(yù)測米象CPs信號肽。分別提取CPs家族保守結(jié)構(gòu)域序列，運用ClustalW軟件進行多重序列比對，并結(jié)合在線工具WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)繪制保守結(jié)構(gòu)域LOGO圖，分析CPs各家族序列特征及保守氨基酸的出現(xiàn)頻率。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

分別獲取昆蟲(米象、赤擬谷盜、馬鈴薯甲蟲、黑腹果蠅、家蠶等)CPR家族保守R&R基序，CPAP1和CPAP3家族保守ChtBD2結(jié)構(gòu)域，以及Tweedle、CPLCG、CPLCP、CPCFC、CPF和CPFL家族不包含信號肽的全長氨基酸序列。運用ClustalW對上述對應(yīng)氨基酸序列進行多重比對。利用Mega 6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)分別開展昆蟲不同家族CPs氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，其中各樹分支都進行1 000次重復(fù)抽樣檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 米象CP基因的全基因組鑒定

基于米象基因組共鑒定獲得135個CP基因，隸屬9個家族：CPR(RR1，RR2和CPRNC)、Tweedle、CPAP1、CPAP3、CPLCG、CPLCP、CPF、CPFL和CPCFC，其中有85.93%(116個)的CPs包含信號肽。通過與鞘翅目昆蟲赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲的CPs比較分析發(fā)現(xiàn)，不同昆蟲間CPs的數(shù)量存在較大差異，馬鈴薯甲蟲(175個)CPs個數(shù)最多，赤擬谷盜(151個)次之，米象(135個)最少，其中不同昆蟲間尤以CPR家族基因的數(shù)量差異最為明顯(表1)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲的CPs缺少CPLC家族，米象則無CPLCA家族基因(表1)。

表1 三種鞘翅目昆蟲表皮蛋白基因匯總表

2.2 CPR家族基因

本研究共鑒定獲得含保守R&R基序的CPR家族基因93個，占米象CP基因總數(shù)的68.89%。依據(jù)CuticleDB運算，米象CPR家族分別包含43個RR1亞家族和45個RR2亞家族成員，另有5條基因序列被定義為CPRNC(未分類CPR)(表1)。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示RR1、RR2和CPRNC各自聚為一支，證實上述CPR亞家族分類的準確性(圖1a)。有趣的是，CuticleDB數(shù)據(jù)庫分類結(jié)果顯示XP_030753085.1蛋白隸屬于RR1亞家族，而進化樹分析結(jié)果則與CPRNC蛋白聚為一支，暗示傳統(tǒng)CPR亞家族分類方法與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系存在不一致性(圖1a)。米象RR1和RR2家族蛋白的R&R保守基序分別如圖1b和圖1c所示，其中RR1家族蛋白擁有8個保守氨基酸識別位點(YTADENGF)，RR2家族蛋白則含有2個保守識別序列(EERDGDVVKG；3個G-x(3)-VV重復(fù)序列)。為進一步探究昆蟲RR1和RR2蛋白的進化關(guān)系，本研究以米象、赤擬谷盜、黑腹果蠅和家蠶的R&R基序進行系統(tǒng)發(fā)育分析，分別構(gòu)建不同昆蟲RR1和RR2家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2和圖3)，結(jié)果表明上述不同昆蟲均形成相應(yīng)物種特異性基因簇，米象RR1蛋白包含4個基因聚類(圖2)，RR2蛋白則擁有8個獨立基因簇(圖3)。

注：a 米象CPR家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)；b 米象RR1蛋白R&R基序分析；c 米象RR2蛋白R&R基序分析。

注：米象(So)，赤擬谷盜(Tc)，黑腹果蠅(Dm)，家蠶(Bm)；黑括號表示基因聚為一簇。

2.3 CPAP1和CPAP3家族基因

在米象基因組中共鑒定獲得13個CPAP1和7個CPAP3家族蛋白基因(表1)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，不同昆蟲CPAP1和CPAP3家族蛋白各自形成兩個不同分支的基因簇，且米象與赤擬谷盜親緣關(guān)系較高，兩個物種的CPAP基因在進化樹中均成對出現(xiàn)(圖4a)。蛋白序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，米象CPAP1和CPAP3家族蛋白序列分別擁有1個和3個保守ChtBD2型幾丁質(zhì)結(jié)合域，且多數(shù)蛋白均含有1個N末端信號肽(除SoCPAP1-B、F、J和M)(圖4b和圖4c)。此外，米象CPAP1序列長度差異較大，氨基酸長度介于170和169 3 aa之間(圖4b)；CPAP3氨基酸序列長度的變異則較小，其范圍為230～281 aa(圖4c)。與此同時，米象CPAP1和CPAP3蛋白家族間的幾丁質(zhì)結(jié)合域數(shù)量和位置存在顯著區(qū)別，即SoCPAP3蛋白的3個幾丁質(zhì)結(jié)合域主要靠近N端，而SoCPAP1蛋白幾丁質(zhì)結(jié)合域在N端、C端和中間位置均有分布(圖4b和圖4c)。

注：a 昆蟲CPAP1和CPAP3家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析。米象(So)，赤擬谷盜(Tc)，黑腹果蠅(Dm)，地中海實蠅Ceratitis capitata(Cc)，家蠶(Bm)，煙草天蛾Manduca sexta(Ms)；b CPAP1和c CPAP3蛋白結(jié)構(gòu)分析。

2.4 Tweedle家族基因

在米象基因組中共鑒定得到6個Tweedle蛋白基因，根據(jù)米象、赤擬谷盜等11種不同昆蟲的氨基酸序列構(gòu)建Tweedle家族蛋白的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，昆蟲Tweedle家族蛋白可形成三個并列基因簇，分別包括蠅蟲類(地中海實蠅和黑腹果蠅)、蚊子類(尖音庫蚊、埃及伊蚊和岡比亞按蚊)的特異性Tweedle基因聚類分支，以及由11種昆蟲共同組成的Tweedle基因混合簇(圖5a)。此外，氨基酸序列分析結(jié)果顯示，米象Tweedle家族蛋白擁有4個保守氨基酸區(qū)域，且每個Tweedle家族成員中均存在一個內(nèi)部重復(fù)結(jié)構(gòu)(圖5b)。

注：a 不同昆蟲Tweedle家族蛋白進化關(guān)系分析，包括米象(So)、赤擬谷盜(Tc)、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata(Ld)、黑腹果蠅(Dm)、地中海實蠅Ceratitis capitata(Cc)、岡比亞按蚊Anopheles gambiae(Ag)、埃及伊蚊Aedes aegypti(Aa)、尖音庫蚊Culex pipiens(Cp)、家蠶(Bm)、麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis(Nv)和意大利蜜蜂Apis mellifera(Am)；b 米象Tweedle蛋白保守序列分析。

2.5 低復(fù)雜度CP家族基因

在米象基因組中共鑒定得到米象低復(fù)雜度CP家族基因7個，包括1個CPLCG基因和6個CPLCP基因，未鑒定到CPLCA基因(表1)。不同昆蟲CPLCG和CPLCP蛋白家族分別聚類形成單獨分支(圖6a)，并且聚集形成4個蚊類基因簇(圖6a)，表明該家族蛋白數(shù)量在蚊子類群中得到顯著擴展。氨基酸保守序列分析顯示，CPLCP蛋白含有高密度脯氨酸PV和PY重復(fù)序列(圖6b)。

注：a 不同昆蟲CPLCG和CPLCP家族蛋白進化關(guān)系分析，包括米象(So)、赤擬谷盜(Tc)、岡比亞按蚊(Ag)、埃及伊蚊(Aa)、尖音庫蚊(Cp)、黑腹果蠅(Dm)、家蠶(Bm)、麗蠅蛹集金小蜂(Nv)和意大利蜜蜂(Am)；b 米象CPLCP蛋白保守序列分析。

2.6 CPF和CPFL家族基因

在米象基因組共鑒定得到1個CPF和5個CPFL家族蛋白基因(表1)。依據(jù)不同昆蟲CPF和CPFL的蛋白序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示這兩個家族蛋白分別聚集形成兩個并列分支(圖7a)。序列分析發(fā)現(xiàn)，鞘翅目昆蟲米象、赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲CPF蛋白分別含有保守的44個氨基酸和C末端序列(圖7b和圖7c)，而CPFL家族蛋白則僅擁有與CPF蛋白同源性較高的C末端保守序列(圖7d)。

注：a 昆蟲CPF和CPFL家族蛋白進化關(guān)系分析，包括米象(So)、赤擬谷盜(Tc)、馬鈴薯甲蟲(Ld)、黑腹果蠅(Dm)和地中海實蠅(Cc)；(b和c)米象、赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲CPF保守結(jié)構(gòu)域分析；d 米象、赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲CPFL保守結(jié)構(gòu)域分析。

2.7 CPCFC家族基因

本研究在米象基因組中共注釋得到3個CPCFC家族蛋白基因(表1)。為明確CPCFC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，共選擇9種雙翅目和3種鞘翅目昆蟲的CPCFC蛋白序列開展系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明這兩大類昆蟲的CPCFC蛋白各自聚集形成一簇(圖8a)。米象、赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲)3種鞘翅目昆蟲的CPCFC氨基酸序列分析結(jié)果顯示，該家族蛋白具有共同的保守結(jié)構(gòu)域，即兩個重復(fù)的C-X5-C基序(圖8b)。

注：a 昆蟲CPCFC家族蛋白進化關(guān)系分析，包括米象(So)、赤擬谷盜(Tc)、馬鈴薯甲蟲(Ld)、桔小實蠅Bactrocera dorsalis(Bd)、瓜實蠅Bactrocera cucurbitae(Bc)、地中海實蠅(Cc)、黑腹果蠅(Dm)、埃及伊蚊(Aa)、岡比亞按蚊(Ag)、不吉按蚊Anopheles funestus(Af)、中華按蚊Anopheles sinensis(As)、四斑按蚊An.quadrimaculatus(Aq)；b 米象、赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲CPCFC保守結(jié)構(gòu)域分析。

3 討論

作為昆蟲表皮重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，CPs不僅種類數(shù)量眾多，而且在昆蟲生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等方面均發(fā)揮關(guān)鍵作用，是開發(fā)新型害蟲控制劑的理想靶標[24, 25]。本研究運用生物信息學(xué)手段從米象基因組數(shù)據(jù)中共鑒定得到135個CPs基因，隸屬于9個家族，包括CPR、Tweedle、CPAP1、CPAP3、CPLCG、CPLCP、CPF、CPFL和CPCFC。

本研究發(fā)現(xiàn)同屬鞘翅目昆蟲的米象、赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲的CPs數(shù)量差異明顯。已有研究證實CPs基因的存在可能與昆蟲應(yīng)對外界復(fù)雜環(huán)境密切相關(guān)，因此造成物種間CPs數(shù)量和種類巨大差別的可能原因是不同種類昆蟲所處生存環(huán)境的差異[26,27]。由于米象和赤擬谷盜均為儲糧害蟲，其活動范圍主要集中在環(huán)境穩(wěn)定的糧倉內(nèi)，相比而言馬鈴薯甲蟲的生存環(huán)境則更為復(fù)雜，因此其擁有CPs數(shù)量也較多。此外，與赤擬谷盜相比，米象幼蟲期和蛹期均于稻谷內(nèi)部進行發(fā)育，其相對穩(wěn)定和受保護的生長環(huán)境可能導(dǎo)致該昆蟲進化出的CPs數(shù)量少于赤擬谷盜。

米象CPs另外一個重要特點是諸多CPR家族蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上呈現(xiàn)聚類現(xiàn)象，即在進化樹上形成許多相應(yīng)物種的特異性CPs基因簇，這意味著聚集的CPs基因具有較高的序列相似度和協(xié)調(diào)一致的進化模式。前人亦分別在家蠶、斜紋夜蛾、馬尾松毛蟲、岡比亞按蚊等昆蟲中發(fā)現(xiàn)類似的物種特異性CPR基因聚類，經(jīng)證實這些基因均來源于染色體上的同一個基因簇，暗示其可能是從同一個祖先基因進化而來，且在各物種中分別進行擴增，結(jié)果進一步證明CPs基因的復(fù)制是在各昆蟲類群中獨立發(fā)生[10, 15, 27-29]。

除CPRs外，CPAPs是昆蟲第二大類幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，其依據(jù)氨基酸序列所包含幾丁質(zhì)結(jié)合域(ChtBD2)數(shù)量，被進一步分為CPAP1(包含1個ChtBD2)和CPAP3(3個ChtBD2)兩個家族[22]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)昆蟲CPAPs與CPR蛋白之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系存在巨大差異，即不同昆蟲CPAP1和CPAP3同一家族成員間的親緣關(guān)系要強于同一物種各個蛋白間的關(guān)聯(lián)度，顯示出這些蛋白是依據(jù)某些特定保守結(jié)構(gòu)域進化而來，暗指CPAPs發(fā)展成為多基因家族的過程要早于不同種類昆蟲的分化過程。之前的研究發(fā)現(xiàn)昆蟲CPAP1家族基因的數(shù)量在不同物種間變異較大(9-17個)[30]，本論文中米象較赤擬谷盜缺少CPAP1-D和CPAP1-E基因。

與其他CPs相比，不同種類昆蟲間CPAP3家族基因的數(shù)量、種類及其氨基酸序列結(jié)構(gòu)最為保守[30,31]，并且已有研究證實CPAP3蛋白與幾丁質(zhì)均有較高的結(jié)合能力[32]，暗示該家族蛋白可能通過與表皮中的幾丁質(zhì)結(jié)合從而在節(jié)肢動物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。例如，果蠅CPAP3-A和CPAP3-E蛋白通過與幾丁質(zhì)相互作用來控制昆蟲表皮完整性、表皮外骨骼物理性質(zhì)以及幼蟲體型[33, 34]。赤擬谷盜CPAP3家族蛋白則承擔著多樣的生理功能，利用RNA干擾技術(shù)有效沉默該家族不同基因會對昆蟲鞘翅、表皮角質(zhì)層、腸道、卵巢、脂肪體、足、胚胎等造成嚴重發(fā)育缺陷，從而導(dǎo)致死亡表型[5]。這些研究結(jié)果證明昆蟲特定的關(guān)鍵CPs，如CPAP3家族基因可成為基于dsRNA控制米象的潛在靶位點，后續(xù)可進一步針對該家族基因開展功能研究，驗證其在米象生理發(fā)育過程中的重要功能。

4 結(jié)論

表皮覆蓋于蟲體外表面，承擔昆蟲外骨骼的功能，在昆蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，并可抵御外界不良環(huán)境，如病原體、殺蟲劑等，是昆蟲的一道天然保護屏障。幾丁質(zhì)和不同種類的CPs的比例是決定昆蟲表皮結(jié)構(gòu)、特性和機械性能的關(guān)鍵因素。因此，本論文針對米象CPs的全基因組鑒定研究不僅可以豐富昆蟲CP超基因家族數(shù)據(jù)，還可為開展米象CP基因功能及生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)的基因序列信息，最終為米象等儲糧害蟲的新型防控策略奠定重要基礎(chǔ)。