家蠶中腸內(nèi)對(duì)辛硫磷耐受性細(xì)菌的篩選與鑒定＊

張洪滔 ，朱清宇 ，李 兵，2，李凡池，2＊

（1.蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué) 蠶桑研究所，江蘇 蘇州 215123）

昆蟲腸道細(xì)菌及其功能的研究是當(dāng)今農(nóng)林昆蟲的研究熱點(diǎn)之一，一系列的研究揭示了腸道細(xì)菌重要的生態(tài)學(xué)功能［1，2］，如改善宿主昆蟲的營(yíng)養(yǎng)吸收［3，4］、解除殺蟲劑的毒害［5］、抵御病原菌和天敵的入侵［6，7］、合成昆蟲信息素等［1，8］。宿主昆蟲與其中腸微生物之間相互依存，相互影響，相互制約。遺傳證據(jù)表明，細(xì)菌和真菌到家蠶的大規(guī)模水平基因轉(zhuǎn)移，可能增加家蠶（Bombyx mori）的存活和繁殖力，并表明微生物在家蠶進(jìn)化中的重要作用［9］。眾所周知，昆蟲腸道微環(huán)境影響腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和多樣性，以及它們的代謝活動(dòng)，可能在昆蟲中具有生理效應(yīng)。

昆蟲生活在農(nóng)田、野地和森林中，不可避免的會(huì)受到來自天敵、農(nóng)藥等方面的侵害。昆蟲的腸道微生物除了可以促進(jìn)宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收，還能夠防御環(huán)境中所遇到的天敵、病原微生物等生物因素的入侵［10］。茶長(zhǎng)卷蛾（Homona magnanima）的腸道微生物對(duì)抑制外界環(huán)境中蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）的入侵有顯著的作用［11］；歐洲熊蜂（Bombus terrestris）的腸道中存在對(duì)抗寄生蟲的細(xì)菌，這些細(xì)菌能顯著減少寄生蟲的數(shù)量［12］，表明腸道微生物有助于保護(hù)宿主昆蟲免受寄生蟲和病原菌的危害。另外，腸道菌群還可以在農(nóng)藥和重金屬等非生物因素入侵宿主后，發(fā)揮解毒作用。家蠶腸道微生物中的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugino?sa）能有效地降解殺蟲劑，鞘氨醇單胞菌屬（Sphin?gomonas）有增加殺蟲劑抗性的作用［13］；豆綠蝽象（Aspongopus chinensis Dallas）腸道中的伯克霍爾德菌（Burkholderia）可以降解毒害宿主的農(nóng)藥殺螟硫磷［14］。Cheng等人研究發(fā)現(xiàn)桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）共生菌檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.）的磷酸水解酶基因在敵百蟲降解中起著關(guān)鍵作用［5］。這些研究表明腸道共生菌介導(dǎo)的殺蟲劑降解在宿主殺蟲劑抗性方面起著重要的作用。

家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲。家蠶經(jīng)過長(zhǎng)期的定向選擇，家蠶對(duì)野外不良環(huán)境（如紫外線、高溫、化學(xué)農(nóng)藥等）的抗性較弱［15］。在中國(guó)，每年農(nóng)田治蟲、化學(xué)農(nóng)業(yè)污染桑葉都會(huì)對(duì)以桑葉為主要飼料的家蠶的生存產(chǎn)生嚴(yán)重的危害［16］。微量農(nóng)藥中毒引起家蠶不結(jié)繭已經(jīng)成為影響我國(guó)蠶絲業(yè)健康發(fā)展的重要因素。辛硫磷是一種經(jīng)典有機(jī)磷農(nóng)藥，在世界絕大部分地區(qū)都被廣泛使用，農(nóng)藥殘留在桑葉上的情況時(shí)有發(fā)生，而辛硫磷具有廣譜性，對(duì)非靶標(biāo)昆蟲也存在危害［17］。隨著辛硫磷的廣泛使用，不少昆蟲產(chǎn)生了抗藥性，增加了害蟲防治的難度［17］，而許多腸道微生物能降解農(nóng)藥，增加宿主對(duì)農(nóng)藥的抗性［5］，宿主腸道內(nèi)特殊菌群的變化可能與農(nóng)藥抗性之間存在密切關(guān)系。家蠶幼蟲的腸道中存在著大量的細(xì)菌群落［18］，尚未有研究報(bào)道家蠶腸道內(nèi)是否存在一些辛硫磷耐受菌。本試驗(yàn)對(duì)家蠶腸道辛硫磷耐受性細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定，并對(duì)其辛硫磷抗性能力進(jìn)行測(cè)定，期望通過辛硫磷耐受菌提高家蠶對(duì)辛硫磷的抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試農(nóng)藥

辛硫磷（CAS：14816-18-3，純度≥98%）購(gòu)自Sigma公司。使用1 mL丙酮將100 mg辛硫磷原藥溶解為100 mg/mL的原液，使用丙酮將原液稀釋10倍成工作液（10 mg/mL），再將工作液用雙蒸水稀釋成為終濃度為1.0 μg/mL的辛硫磷溶液。

1.1.2 供試家蠶品種

品種為“菁松×皓月”，購(gòu)置于江蘇東臺(tái)市蠶種場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辛硫磷殺蟲劑抗性菌的篩選與生物學(xué)鑒定

選取5齡第3 d家蠶，用70%的乙醇進(jìn)行體表消毒，并用滅菌的0.7%鹽水沖洗，再進(jìn)行解剖。將中腸轉(zhuǎn)移到裝有0.7%鹽水的滅菌離心管中，碾碎，稀釋100倍。加入辛硫磷濃度為100 mg/L的改良基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中（基礎(chǔ)培養(yǎng)基MM：NH4Cl 1.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.0，加入100 mg/L的辛硫磷作為碳源），于30℃條件下，200 r/min搖床上培養(yǎng)5 d，以1%的接種量接入到相同的培養(yǎng)基中，傳代3次。然后取0.5 mL富集液梯度稀釋，取細(xì)胞數(shù)為105，106，107，108個(gè)/mL的稀釋液各0.1 mL涂布于加有100 mg/L辛硫磷的LB培養(yǎng)基平板上，30℃條件下培養(yǎng)3 d后，發(fā)現(xiàn)部分單菌落的周圍有黃綠色水解圈，挑取此單菌落接種于LB培養(yǎng)基的試管中，以1%接種量取細(xì)菌懸液接種到加有100 mg/L辛硫磷的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，于30℃條件下，在200 r/min搖床培養(yǎng)3 d。

對(duì)于能夠以辛硫磷為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，采用DNA提取試劑盒提取DNA，用細(xì)菌16S rDNA通用引物 8F（5’-GCGGATCCGCGGCCGCTGCAGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′）-1492R（5’-GGCTC?GAGCGGCCGCCCGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增其16s rRNA基因片段，并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果分別與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式菌株和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，確定各細(xì)菌的種和分類地位。

1.2.2 抗性菌的生測(cè)分析

將篩選出的耐受菌在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12 h（30 ℃，200 rpm），將50 mL稀釋至光密度（OD600=0.4）的細(xì)菌培養(yǎng)物以4500 rpm離心5 min，并使用50 mL ddH2O將細(xì)菌沉淀重懸，然后均勻地噴灑在50 g桑葉表面，對(duì)照組則使用ddH2O噴灑后晾干。在5齡起蠶時(shí)，將家蠶分為對(duì)照組和不同耐受菌處理組，分別使用處理過的桑葉對(duì)家蠶幼蟲進(jìn)行飼養(yǎng)。并收集家蠶糞便進(jìn)行菌落培養(yǎng)，對(duì)生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行檢測(cè)鑒定，確保耐受菌定殖成功。Peng等人的研究表明辛硫磷對(duì)5齡第3 d家蠶的半致死濃度（LC50）（24 h）是 7.86 μg/mL［19］，本研究中選用了1.0 μg/mL作為實(shí)驗(yàn)濃度。將新鮮的桑葉浸入1.0 μg/mL的辛硫磷溶液或ddH2O中1 min后，室溫晾干。在5齡第3 d使用辛硫磷溶液處理過的桑葉喂食實(shí)驗(yàn)組幼蟲，對(duì)照組使用ddH2O處理。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組30頭家蠶幼蟲，并設(shè)置3組重復(fù)，分別記錄家蠶幼蟲的體重和存活率。

2 結(jié)果

2.1 篩選具有辛硫磷耐受性的菌種

將辛硫磷作為改良基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中唯一的碳源，篩選對(duì)辛硫磷具有耐受性的菌株。然后通過平板劃線法培養(yǎng)菌群，挑選其中的單菌落再次培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序分析、序列比對(duì)得出各菌株的序列號(hào)以及相似程度，結(jié)果匯總在表1中。篩選出了7種對(duì)辛硫磷具有耐受能力的菌種，包括鞘氨醇單胞菌（Sphin?gomonas spp.）、微桿菌（Microbacterium spp.）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri spp.）、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens spp.）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter spp.）、密歇根克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis spp.）和煙草節(jié)桿菌（Arthrobacter nicotianae spp.）。

表1 篩選出的具有辛硫磷耐受性的菌株序列Table 1 Sequence of Phoxim-tolerant Bacteria Screened out

2.2 家蠶取食辛硫磷耐受菌后的體重變化統(tǒng)計(jì)

5齡起蠶開始連續(xù)添食家蠶辛硫磷耐受菌處理的桑葉2 d，各處理組均未出現(xiàn)死亡蠶。由表2可見，處理1 d對(duì)照組家蠶平均體重1.22±0.10 g/頭蠶，B4處理組最低為1.14±0.17 g/頭蠶，B7處理組最高為1.50±0.13 g/頭蠶；處理2 d對(duì)照組家蠶平均體重1.73±0.23 g/頭蠶，處理組中B4組家蠶平均體重最低，為2.06±0.24 g/頭蠶，B5組家蠶平均體重最高，為2.28±0.20 g/頭蠶，處理組家蠶體重呈現(xiàn)高于對(duì)照組家蠶的趨勢(shì)。

表2 家蠶取食辛硫磷耐受菌后的體重統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical Analysis on the Body Weight of the Silkworms Fed with Phoxim-tolerant Bacteria （單位：g/頭蠶）

2.3 辛硫磷耐受菌處理后家蠶對(duì)辛硫磷的抗性檢測(cè)分析

5齡起蠶連續(xù)添食家蠶辛硫磷耐受菌處理的桑葉2 d后，開始連續(xù)添食家蠶1.0 μg/mL辛硫磷處理的桑葉。由表3可見，7種辛硫磷耐受菌處理后的家蠶在辛硫磷持續(xù)暴露下，體重均高于對(duì)照組家蠶。辛硫磷暴露96 h后，處理組中B2組家蠶平均體重最低，為4.04±0.31 g/頭蠶，B5組家蠶平均體重最高，為4.36±0.44 g/頭蠶。

表3 辛硫磷耐受菌處理后家蠶暴露在辛硫磷下的體重變化統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical Analysis on Body Weight Changes of Silkworms Exposed to Phoxim after Treatment with Phoxim-tolerant Bacteria （單位：g/頭蠶）

檢測(cè)辛硫磷耐受菌處理后的家蠶暴露在辛硫磷下的存活率情況。由表4可見，在24 h、48 h、72 h和96 h，對(duì)照組的存活率分別為86.67%、70.00%、53.33%和26.67%，而B1處理組家蠶存活率為96.67%、90.00%、83.33%和76.67%，B3處理組家蠶存活率為96.67%、93.33%、90.00%和86.67%，B6處理組家蠶存活率為90.00%、86.67%、80.00%和73.33%。B1、B3和B6三種辛硫磷抗性菌處理后的家蠶暴露在辛硫磷下的存活率均明顯高于對(duì)照組。

表4 辛硫磷耐受菌處理后家蠶暴露在辛硫磷下的存活率統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical Analysis on Survival Rate of Silkworm Exposed to Phoxim after Treatment with Phoxim-tolerant Bacteria

3 討論

目前已明確昆蟲對(duì)殺蟲劑的抗性機(jī)制包括表皮穿透率下降、靶標(biāo)抗性以及代謝抗性，其中代謝抗性機(jī)制較為普遍，如細(xì)胞色素P450酶（P450s）、羧酸酯酶（CarE）及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）等重要解毒酶系［20］。人為提高昆蟲對(duì)殺蟲劑的抗性包括：抗性品種的選育，靶標(biāo)基因突變和轉(zhuǎn)基因等手段。本研究中，家蠶取食幾種辛硫磷耐受菌處理的桑葉2 d后，體重未出現(xiàn)降低或者死亡的情況，表明幾種辛硫磷耐受菌對(duì)家蠶無毒害作用。辛硫磷處理后，7種辛硫磷耐受菌處理后的家蠶在辛硫磷持續(xù)暴露下，體重均高于對(duì)照組家蠶。鞘氨醇單胞菌、松鼠葡萄球菌和密歇根克雷伯氏菌3種辛硫磷抗性菌處理后的家蠶暴露在辛硫磷下的存活率均顯著高于對(duì)照組，表明這3種辛硫磷耐受菌能提高家蠶對(duì)辛硫磷的耐受性。粘質(zhì)沙雷氏菌在一些昆蟲中是一種條件致病菌，雖然能夠耐受辛硫磷，但在宿主昆蟲受到殺蟲劑脅迫下可能會(huì)造成致病危害［21］。微桿菌、不動(dòng)桿菌以及和煙草節(jié)桿菌處理的家蠶暴露在辛硫磷下存活率與對(duì)照組相似或者略高于對(duì)照組。這3種菌在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)辛硫磷有耐受能力，但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中未能達(dá)到顯著的作用，可能是該菌種在家蠶體內(nèi)缺乏有效的作用條件，限制了降解辛硫磷的能力。本實(shí)驗(yàn)表明可以通過添加辛硫磷耐受細(xì)菌來提高家蠶對(duì)辛硫磷的耐受性。

腸道微生物與殺蟲劑互作可能增強(qiáng)宿主對(duì)殺蟲劑的抗性。在腸道微生物與化學(xué)農(nóng)藥相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，伯霍爾德桿菌（Burkholderia）能夠有效介導(dǎo)點(diǎn)蜂緣蝽（Riptortus pedestris）對(duì)殺螟松的抗性［14］。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）有增加家蠶對(duì)殺蟲劑抗性的作用［13］。假單胞菌能夠介導(dǎo)草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）對(duì)殺蟲劑抗性，如溴氰菊酯和多殺菌素［22］。本研究中鞘氨醇單胞菌、松鼠葡萄球菌和密歇根克雷伯氏菌3種辛硫磷耐受菌是否能夠提高家蠶對(duì)其它有機(jī)磷類殺蟲劑，甚至其它類型殺蟲劑的耐受性值得進(jìn)一步研究。