利用蠶蟲草培育過程的優(yōu)化以提高蟲草素產(chǎn)量的研究進(jìn)展＊

錢趙裔，陳玉銀

（浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310030）

1 引言

《本草從新》中記載：“冬蟲夏草，四川嘉定府所產(chǎn)者最佳，云南、貴州所產(chǎn)者次之。冬在土中，身活如老蠶，有毛能動，至夏則毛出土上，連身俱化為草?！弊怨乓詠?，冬蟲夏草因其嚴(yán)苛的生長環(huán)境要求、稀少的產(chǎn)量和重要的藥用價值而價值千金。即便是到了現(xiàn)代，冬蟲夏草的人工培育技術(shù)仍未取得滿意的結(jié)果，冬蟲夏草的產(chǎn)量少，所以價格也一直是居高不下。

在市場上有一類不那么昂貴的“蟲草”，即蛹蟲草，又叫北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草。這兩者的共同之處在于具有相似的生物學(xué)活性成分，有些品種的形態(tài)相似，所以在生活中經(jīng)常有人將二者混為一談，但其實(shí)二者還是有很大差異的。蛹蟲草和冬蟲夏草雖然都是子囊菌門，肉座目，麥角菌科，蟲草屬的真菌，但是冬蟲夏草是冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲的尸體的復(fù)合體，寄主專一，而蛹蟲草的真菌類型更多，且寄體多樣；冬蟲夏草的形成條件需要高海拔，生境嚴(yán)苛，中華冬蟲夏草更是中國所特有的，而天然的蛹蟲草雖然產(chǎn)量不高，但是它全球性分布，而且人工蛹蟲草栽培技術(shù)的成熟更是大大提高了其產(chǎn)量。

因?yàn)槎x夏草的人工培育十分困難，并且由于環(huán)境的破壞，野生蟲草的產(chǎn)量也在下降，所以人們對蛹蟲草的人工栽培技術(shù)進(jìn)行了全方位的研究。而蠶蟲草—一種由蛹蟲草菌寄生于家蠶幼蟲身上并產(chǎn)生子實(shí)體的一種蟲菌復(fù)合物［1］—因其寄主最易大規(guī)模飼養(yǎng)、其形態(tài)最接近冬蟲夏草、其藥用價值很高等特點(diǎn)，被認(rèn)為是“野生冬蟲夏草最佳的替代品［1］”，因而對蠶蟲草的研究也成為熱點(diǎn)之一。

在冬蟲夏草和蠶蟲草中都含有蟲草素（cordyce?pin），即3’-脫氧腺苷（3’-deoxyadenosine），是重要的生物活性成分之一，也是衡量冬蟲夏草和蠶蟲草產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，具有重要的藥用價值，并且蠶蟲草中的蟲草素比在冬蟲夏草中的含量高出了數(shù)倍［1～4］。由于野生蟲草的產(chǎn)量下降，冬蟲夏草又難以人工培育來擴(kuò)大產(chǎn)量，在具有寄體易大規(guī)模飼養(yǎng)、蟲草素等生物活性成分含量高的優(yōu)勢下，蠶蟲草的規(guī)?；⒐S化、品質(zhì)化受到十分的關(guān)注，關(guān)于如何提高蠶蟲草中蟲草素含量的問題也有較多的研究，本文將就如何通過優(yōu)化蠶蟲草培育過程以提高蠶蟲草中蟲草素產(chǎn)量的問題進(jìn)行分析、總結(jié)和討論。

2 蟲草素

2.1 理化性質(zhì)

蟲草素，屬嘌呤類生物堿，分子式為C10H13N5O3，相對分子質(zhì)量為251.24，熔點(diǎn)為230℃～231℃，堿性，針狀或片狀結(jié)晶，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波長為260 nm［5］，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 蟲草素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural Formula of Cordycepin

2.2 生物活性

蟲草素具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗腫瘤、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、減肥、治療白血病等作用［1～2、6～8］，在新型冠狀病毒肺炎的防治中也可起到積極作用［9］，具有多種藥理作用，在生物醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［7］。

2.3 主要來源

①化學(xué)方法合成；②從天然蟲草或人工培育的蟲草子實(shí)體或其子座中提??；③篩選高產(chǎn)蟲草素的優(yōu)良蟲草菌株，通過液態(tài)培養(yǎng)等方法發(fā)酵產(chǎn)生蟲草素，從菌絲體和發(fā)酵液中分離純化提取蟲草素［10］。

2.4 蠶蟲草中的分布

蟲草素在蠶蟲草中主要分布在子實(shí)體和蠶體，也即整體都有，但其在子實(shí)體和蠶體中的含量多少有所差別，但是并不絕對。在申鴻等的研究中，子實(shí)體的蟲草素高于蠶體，而在孫迎節(jié)等的研究中結(jié)果卻相反，其可能的影響因素是多樣的，比如家蠶品種、菌種品種和培育環(huán)境等［6］。但主要還是從子實(shí)體中提取。

2.5 提取方法

微波輔助法、超聲輔助法、超臨界萃取法、加速溶劑萃取法和纖維素酶輔助法［7、11］。

2.6 測定方法

主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI/MS）法及薄層色譜掃描法等，最常用的為高效液相色譜法［5］。

3 通過優(yōu)化蠶蟲草培育過程提高蟲草素產(chǎn)量的方法

3.1 優(yōu)化蛹蟲草菌株選育

若要獲得高產(chǎn)蟲草素的菌株，一般在自然狀態(tài)獲取的蛹蟲草菌株中篩選是十分低效的，因?yàn)樽匀环蛛x得到的菌株一般蟲草素產(chǎn)量不高，而更加有效的方法是對其進(jìn)行誘變育種以篩選出高產(chǎn)菌株［5］。誘變的方法有化學(xué)誘變、輻射誘變、航天誘變和超聲誘變等［5，10］，可單獨(dú)使用，也可復(fù)合使用。

在曹照平［10］的研究中，聯(lián)合使用了超聲誘變和化學(xué)誘變，成功獲得了雙重營養(yǎng)缺陷型突變株，其提高蟲草素產(chǎn)量的機(jī)理在于嘌呤核苷酸的代謝途徑的改變，有目的地阻斷蛹蟲草菌的代謝途徑，使其核酸代謝流向積累蟲草素的方向。但其實(shí)高產(chǎn)菌株的選育研究主要是應(yīng)用于液體培養(yǎng)途徑，而不是蠶蟲草的蟲草素提取途徑，筆者認(rèn)為，若要應(yīng)用于蠶蟲草的蟲草素提取途徑，需要考慮蠶寄體所能提供給菌體的營養(yǎng)成分，而顯然，這些營養(yǎng)成分的組成是難以像調(diào)整液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)組成一樣的可以針對性改變的，因此誘變選育的方法更適用于液體培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生蟲草素的途徑。而從蠶蟲草中提取蟲草素的途徑中，最佳菌種的篩選需要考慮蠶的感染率最高的菌株，畢竟整體上蠶蟲草的蟲草素產(chǎn)量和成功感染蟲草菌的概率正相關(guān)。

3.2 優(yōu)化接種菌株方案

通過接種方案的優(yōu)化來提高蠶的感染率，從而提高蟲草素的產(chǎn)量。首先是接種的蠶幼蟲（本文考慮的蠶寄體僅活體蠶幼蟲，不考慮死體蠶）的不同齡期（齡期指每次蛻皮的間隔時間）選擇，最佳時間為5齡2 d～4 d［2］，這種接種時間下的蠶感染效果最好，雜菌感染的情況最少。其次是接種方法的選擇，可選擇的有添食、體噴、穿刺、注射［12］等，常用的接種方法有液體菌種注射法和液體菌種穿刺法，在不同的研究中注射法與穿刺法的相對優(yōu)劣情況不同，但使用最廣泛的的還是注射法［4］。

3.3 優(yōu)化培育條件

3.3.1 滅菌方法優(yōu)化

滅菌方法有化學(xué)試劑（如75%的酒精、84消毒液）、紫外殺菌和高溫滅菌，其中化學(xué)試劑法和紫外殺菌法用于活體蠶的滅菌。由于化學(xué)試劑殺菌會對蠶的活力和雜菌感染情況造成較大影響，而高溫滅菌會造成蠶體內(nèi)一些有效成分的破壞，所以效果最佳的是紫外滅菌法。

3.3.2 前期培養(yǎng)溫度優(yōu)化

前期培養(yǎng)是指在蠶幼蟲接種蟲草菌后的一段時間培養(yǎng)，在前期培養(yǎng)階段，溫度與蠶體的抵抗力、生長速率和蠶體內(nèi)雜菌的生長速度等相關(guān)，首先，在溫度過低的情況下，蠶易死亡，且蟲草菌的生長速度十分緩慢；在溫度過高的情況下，家蠶體內(nèi)的雜菌生長速度將遠(yuǎn)快于蟲草菌，蟲草菌感染失敗。故此，可以想見，在溫度由低到高的變化下，感染率將先升后降，在中間的某一溫度將達(dá)到最佳條件。在王蕾［1］的研究中，家蠶在7℃的前期培養(yǎng)溫度下的感染率最高。

3.3.3 注射量的優(yōu)化

注射量過低將難以感染蠶體，一旦結(jié)蛹，感染失?。蛔⑸淞窟^高將使蠶體過早死亡，失去蠶體對雜菌的抵抗力后雜菌大量繁殖，蠶體腐爛，感染失敗。在不同的情況（比如不同菌株）下，最佳注射量有所不同，在顧寅鈺等［12］的研究中0.05 ml～0.1 ml最佳，而在王蕾［1］的研究中0.3 ml～0.4 ml最佳。因此最佳注射量需要通過在具體條件下的多次試驗(yàn)得到。

3.3.4 培養(yǎng)土的優(yōu)化

在覆土培育蠶蟲草的條件下，培養(yǎng)土的種類和含水量可能通過影響蠶體流出液體中雜菌的生長和蠶體的生長而影響感染率和出草率。

3.4 優(yōu)化干燥條件

在蠶蟲草的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，干燥是一個重要的環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)干燥條件的不同會影響蠶蟲草活性成分的含量，由于干燥條件涉及含水率和干燥速率等，其可能會對蟲草素的保存造成影響，從而影響蟲草素的含量。在顧寅鈺等［13］的研究中發(fā)現(xiàn)微波干燥優(yōu)于烘干。

4 總結(jié)與討論

蠶蟲草優(yōu)化培育會直接或間接地提高蠶蟲草蟲草素的產(chǎn)量，任何優(yōu)化方案都需要經(jīng)過在特定條件下的單一變量試驗(yàn)才能確定，但各種優(yōu)化范圍具有一定的普適性。

在本綜述中，筆者只專注于基于蠶蟲草培育優(yōu)化來提高蠶蟲草中蟲草素產(chǎn)量的方法，但實(shí)際上，單純就蟲草素而言，目前，天然和人工培養(yǎng)蟲草子實(shí)體的生長周期長，培養(yǎng)件復(fù)雜且不易控制，子實(shí)體中蟲草素含量只有0.2%～0.6%，提取效率不高，而且具有一定的季節(jié)性局限，制約蟲草素進(jìn)一步研究和開發(fā)利用；而液體發(fā)酵生產(chǎn)周期短，發(fā)酵過程容易控制，產(chǎn)物獲得目的性強(qiáng)，還可以對液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高蟲草素的產(chǎn)量，因此，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的途徑己經(jīng)慢慢發(fā)展為蟲草素的主要來源之一［10］。因此，若就蟲草素而言，作者認(rèn)為對如何提高蟲草素產(chǎn)量的這一問題的研究價值并不高。

在菌種誘變選育方面，這與蟲草素的生物合成途徑息息相關(guān)。隨著蛹蟲草菌基因組的全測序完成，以及蟲草素生物合成途徑的前期研究進(jìn)展［14］，我們可以展望通過基因工程來簡化蟲草素的獲取方法并提高蟲草素的產(chǎn)量或擴(kuò)大蟲草素生產(chǎn)規(guī)模。