納米載導RNAi技術(shù)在害蟲防治中的研究和應(yīng)用

王曉迪，冀順霞，申曉娜，劉萬學，萬方浩，張桂芬，呂志創(chuàng)

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點研究室，北京 100193）

據(jù)統(tǒng)計，我國常見農(nóng)作物病蟲害有 1700多種，且我國每年都有重大病蟲害流行和暴發(fā)，其中常見農(nóng)作物病害有775種、害蟲739種、雜草109種、鼠害42種，其具有分布范圍廣、成災(zāi)頻率高、突發(fā)性強等特點，隨之引發(fā)農(nóng)作物大面積減產(chǎn)，甚至絕收，同時病蟲害也會導致農(nóng)作物品質(zhì)嚴重下降，尤其是外來生物入侵種更增加了對農(nóng)業(yè)的危害性[1-4]。2017年 8月在我國新疆伊犁地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)的番茄潛葉蛾Tuta absoluta具有非常強的快速傳播和適應(yīng)能力，現(xiàn)已在新疆、云南、貴州、四川、廣西、重慶、湖南、江西等8個省/直轄市/自治區(qū)的130多個縣（市、區(qū)）均有發(fā)生，發(fā)生面積逾10萬畝次/年，潛在受害面積逾9700萬畝，對番茄和馬鈴薯潛在直接經(jīng)濟損失逾370億元[5,6]。2018年12月草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda入侵我國[7]，目前已擴散至我國西南、華南、江南、長江中下游、黃淮、西北、華北地區(qū)的 26 ?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的1518個縣（區(qū)、市）[8]，2019年草地貪夜蛾在我國的發(fā)生面積高達1500多萬畝，玉米受害面積占比98%，直接經(jīng)濟損失約100億元[9-11]。由此可見農(nóng)業(yè)害蟲的危害力之大，危害范圍之廣，因此對其進行有效防控十分必要。

目前的防治方法主要包括：農(nóng)業(yè)防治、生物防治、物理機械防治、化學防治等[12]。農(nóng)業(yè)防治技術(shù)基于合理的輪作、灌溉及科學的施肥等栽培技術(shù)和管理技術(shù)，雖可起到害蟲防治的效果，但需精細化管理，費時費力；生物防治技術(shù)基于天敵昆蟲和致病微生物，采用“以蟲治蟲”的方式雖對環(huán)境無污染，但殺蟲作用緩慢，且訓化、繁殖天敵較難；物理防治技術(shù)基于燈光誘殺或溫度滅蟲以及人工捕殺等方式，該方法操作簡單、成本低，但防治效率及效果有限；化學防治技術(shù)基于一種或幾種化學藥劑起到防治害蟲的效果，具有方便、見效快的優(yōu)點，但過度依賴或濫用化學農(nóng)藥導致有害蟲的抗藥性顯著增強、農(nóng)藥殘留超標、環(huán)境污染以及危害健康等一系列問題[13-15]。因此，為對農(nóng)業(yè)害蟲進行有效防控，探索新的綠色、安全、高效的的害蟲防治技術(shù)具有十分重要的意義。RNAi技術(shù)具有昆蟲選擇性和基因特異性，通過對昆蟲的基因研究，篩選出控制生長發(fā)育的關(guān)鍵靶基因，結(jié)合RNAi技術(shù)，對相關(guān)基因進行沉默，從而達到有效防控害蟲的目的。

1 RNAi在害蟲防治中的潛力

RNAi（RNA interference）在2001年和2002年連續(xù)兩次被《Science》評為十大科學技術(shù)之一。RNAi能夠特異性地降低或關(guān)閉靶基因表達，不僅是基因功能研究的重要手段，也是至今為止最有可能應(yīng)用于害蟲防治的生物工程技術(shù)[16]。1998 年，F(xiàn)ire等[17]在對秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans的研究中，發(fā)現(xiàn)并定義了RNA干擾。 RNAi是指由雙鏈RNA（double-strand RNA，dsRNA）所誘發(fā)導致同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制[18]。其基本原理是：外源性的 dsRNA進入細胞后，被受體介導的內(nèi)吞作用吸收后[19,20]，首先由RNaseⅢ核酸酶家族的Dicer與dsRNA結(jié)合，隨后dsRNA被降解成19～21 bp長度的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），然后siRNA與RNA沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，再解旋成單鏈RNA，并由該復(fù)合體主導RNAi效應(yīng)。RISC被活化后，受siRNA引導，通過堿基配對特異性的結(jié)合在同源mRNA（靶標）上切斷靶標mRNA，引發(fā)靶標mRNA的分解，從而產(chǎn)生靶標基因的表達沉默[21,22]，作用過程如圖1所示[23]。

圖1 dsRNA的作用機制[23]Fig. 1 Mechanism of action of dsRNA[23]

昆蟲主要包括外源性siRNA、內(nèi)源性siRNA和miRNA共3種RNAi途徑（圖2）[24]。研究表明抑制昆蟲生長發(fā)育過程中重要基因的表達，可以引起昆蟲生長發(fā)育障礙或者死亡，因此RNAi被認為是一種有效的防控害蟲的潛在方法，從而可避免化學殺蟲劑的過度使用，利于促進可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展[25-28]。昆蟲攝入dsRNA是有巨大潛力進行害蟲治理的防控方法，其特點為：特異性高、抗蟲精準；操作簡便、周期短，極大地節(jié)省人力和時間成本；安全，對非靶標昆蟲影響較小，RNA易降解，無殘留，是環(huán)境友好型的試劑；實用性高，dsRNA可被制備成用于噴霧或灌溉施用的制劑，大面積的施用于田間等[29,30]。

圖2 昆蟲3種RNAi途徑示意圖[24]Fig. 2 Schematic diagram of 3 RNAi pathways in insects[24]

RNAi已在多種鱗翅目昆蟲中成功應(yīng)用[31]。2002年首次報道了鱗翅目昆蟲的RNAi方法，Bettencourt等[32]將dsRNA注入羅賓蛾Hyalophora cecropia蛹的血腔內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血紅素基因沉默導致胚胎死亡，并因此證明了血紅素在羅賓蛾胚胎發(fā)育過程中的重要作用。Quan等[33]將家蠶Bombyx mori白基因（white，Bmwh3）的dsRNA注入野生型家蠶的卵中，發(fā)現(xiàn)可導致Bmwh3位點基因沉默，并誘導出白卵和半透明膚色幼蟲表型，表明Bmwh3dsRNA的作用導致了卵細胞中Bmwh3mRNA積累水平的降低，證明了注射dsRNA可用于昆蟲的基因組功能分析。在斜紋夜蛾Spodoptera litura幼蟲中注射氨肽酶（slapn）dsRNA，發(fā)現(xiàn)幼蟲的apn的表達量減少，對于Cry1C毒素的敏感性相應(yīng)降低。通過將同源dsRNA導入斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)，抑制了斜紋夜蛾apn的表達，證明RNAi在整個幼蟲體內(nèi)起作用[34]。Ellango等[35]檢測了小菜蛾P(guān)lutella xylostella酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因作為RNAi 靶基因的潛力。他們將dsRNA涂抹到卷心菜Brassica oleracea葉片上，讓小菜蛾幼蟲取食，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幼蟲取食dsRNA 3 d后死亡，與對照組相比死亡率顯著增高，且幼蟲死亡率隨dsRNA濃度的增加而增加，最高可達90%。在干擾草地貪夜蛾細胞色素P450的試驗中，發(fā)現(xiàn)飼喂dsRNA可誘導其2齡幼蟲產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，dsRNA對靶基因的沉默率為38.9%～54.3%，與對照組相比差異顯著[36]。以上研究結(jié)果表明，RNAi可成為防治不同鱗翅目害蟲的潛在有力工具，在害蟲管理實踐中具有廣闊的應(yīng)用前景。2015年，Camargo等[37]對番茄潛葉蛾的研究表明其體內(nèi)具有RNAi體系，且對RNAi具有較好的效應(yīng)。進一步基于轉(zhuǎn)錄組信息篩選5個不同發(fā)育時期高表達的靶基因，體外合成dsRNA，并將番茄葉片浸泡于含有靶基因dsRNA的溶液中，然后用于飼喂1齡幼蟲，檢測結(jié)果表明，飼喂dsRNA后，5個靶基因均導致幼蟲體質(zhì)量顯著下降。Camargo等[38]在2016年通過浸泡和PITGS（Plant-induced Transient Insect Gene Silencing）兩種方法將dsRNA導入到番茄葉片中，讓番茄潛葉蛾幼蟲取食含有V-ATPase（Vacuolar ATPase-A）和AK（Arginine kinase）靶基因的dsRNA的葉片，72 h后檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累量分別降低了35% 和40%，24 d后平均死亡率分別達到50%和43%，葉片的損傷率降低，由此可見RNAi作為一種控制番茄害蟲的替代方法是可行的。2019年，Majidiani等[39]通過注射和根傳遞dsRNA的方法，對在番茄潛葉蛾神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)傳遞過程中發(fā)揮重要作用的3個基因——RyRs（ryanodine receptors）、AChE（acetylcholinesterase subunit 1）和nAChRs（nicotinic acetylcholine receptor α6）進行了RNA干擾，試驗結(jié)果顯示注射dsRNA能夠顯著降低靶基因的表達量，注射2 μg和5 μg dsRNA可使基因表達降低62.7%～75.4% ，最大死亡率為92.59%；根系吸收5 μg dsRNA后靶基因表達量降到47%～69%，其死亡率可達到67.1%～80.5%。RNAi在番茄潛葉蛾上的成功應(yīng)用，為今后利用dsRNA防治該害蟲提供了保障。

RNAi也被廣泛的應(yīng)用于其他昆蟲。例如，2012年，dsRNA干擾首次在鞘翅目昆蟲玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgiferaLeConte中應(yīng)用[40]，通過飼喂DvSnf7 dsRNA，5 d后DvSnf7 蛋白水平顯著降低，同時發(fā)現(xiàn)dsRNA效率與靶基因序列的特異性、濃度以及時間等密切相關(guān)[41]。最近的研究表明，通過RNAi 可降低與灰飛虱Laodelphax striatellus節(jié)律行為相關(guān)的tim（timeless）基因的表達，并導致灰飛虱成蟲晝夜節(jié)律紊亂[42]。Santos-Ortega和Killiny[43]對柑橘木虱Diaphorinacitri蔗糖水解酶同系物基因DcSuh進行了鑒定并通過RNAi 技術(shù)對其功能進行分析。他們分別將不同劑量的DcSuh-dsRNA注射到木虱體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 ng 的dsRNA 就能引起木虱幼蟲死亡，在dsRNA 處理后的幼蟲體內(nèi)檢測到蔗糖水解酶活性降低，而成蟲則出現(xiàn)了腹水癥的現(xiàn)象。

以上研究結(jié)果均表明，抑制昆蟲生長發(fā)育過程中重要基因的表達，可以引起昆蟲生長發(fā)育障礙或者死亡，說明RNAi 作為新型防治技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治具有巨大潛力。相較于其他昆蟲，目前存在的問題是，RNAi在鱗翅目昆蟲中應(yīng)用效率較低，其主要原因是dsRNA被細胞吸收的效率較低[44]，因為dsRNA在鱗翅目昆蟲體內(nèi)被降解的速率顯著高于其他昆蟲如鞘翅目昆蟲[45]。大部分 dsRNA進入昆蟲體內(nèi)后會首先被血淋巴或中腸中存在的核酸酶降解，使其不能進入RNAi途徑發(fā)揮沉默靶標基因的功能，因此如何解決這類核酸酶的降解作用是提高RNAi效率的關(guān)鍵[46-50]。

2 RNAi在昆蟲中的研究狀況

為達到有效利用RNAi技術(shù)防控害蟲的目的，提高RNAi的效率是首要前提。首先要篩選有效的靶基因，因為不同基因的RNAi效率差別顯著；同時需要提高dsRNA在昆蟲體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而達到沉默靶基因的效果。

2.1 昆蟲關(guān)鍵功能基因解析

深度解析調(diào)控昆蟲生長發(fā)育、繁殖和行為等方面的關(guān)鍵基因，充分利用害蟲特有的基因和特異性基因序列，是利用RNAi 進行害蟲防治策略成功的關(guān)鍵。昆蟲關(guān)鍵功能基因一般分為以下幾種：干擾保幼激素或蛻皮激素相關(guān)信號通路，導致幼蟲不能正常發(fā)育提前進入蛹期或直接導致死亡[51,52]，如干擾保幼激素受體（Met和Gce等）和轉(zhuǎn)錄因子基因（Kr-h1），可導致幼蟲提前蛹化或直接死亡[53-58]；干擾蛻皮激素相關(guān)信號通路，抑制昆蟲的正?；己陀鸹?，如干擾幾丁質(zhì)合成，促使昆蟲發(fā)育不良，不能正常蛻皮甚至死亡[59-61]，干擾蛻皮激素受體基因（如EcR和USP等）和轉(zhuǎn)錄因子（如Br）也會導致昆蟲產(chǎn)生蛻皮缺陷而死亡[62,63]；擾亂生殖和產(chǎn)卵相關(guān)信號通路，實現(xiàn)控制害蟲種群數(shù)量，如干擾羥基-3-甲基戊二酰輔酶A[64]、卵黃原蛋白受體[65]、表皮蛋白基因[66]、ATP水解酶基因[67]、親環(huán)蛋白B基因[68]；擾亂昆蟲免疫和抗性機制，如對農(nóng)藥抗性、沉默解毒代謝和免疫相關(guān)基因等干擾，降低害蟲對靶標農(nóng)藥的抗性，常見的基因有小G 蛋白Ras基因[69]、細胞色素 P450CYP6AE14、CYP6BG1、CYP321A8、CYP321B1和CYP6AE44基因[70-73]。

保幼激素（Juvenile hormones，JHs）是昆蟲咽側(cè)體（corpora allata，CA）合成并分泌的一種倍半萜烯類物質(zhì)，在昆蟲體內(nèi)不僅調(diào)控幼蟲生長特性、促進卵巢成熟、阻礙幼蟲過早的進入下一齡期[74]，而且參與昆蟲體型外觀、蛻皮、滯育、刺激雌性成蟲體內(nèi)卵黃形成等生理生化過程[75]。蛻皮激素（Ecdysone，Ecd）是由昆蟲的前胸腺合成并分泌的一種類固醇激素，對調(diào)節(jié)昆蟲的生長發(fā)育、代謝和生殖等具有重要作用[76-78]。保幼激素和蛻皮激素協(xié)同調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育[79]，幼蟲期高滴度JH確保高滴度20E（20-hydroxyecdysone）只觸發(fā)幼蟲間的蛻皮，但是末齡幼蟲，JH 滴度下降，同時，高滴度20E 觸發(fā)幼蟲-蛹或幼蟲-成蟲的變態(tài)發(fā)育[51,63,80-84]。保幼激素和蛻皮激素在昆蟲生長發(fā)育過程中必不可少，因此，干擾這兩類物質(zhì)使其不能正常發(fā)揮作用，是利用RNA干擾防治害蟲的最有效途徑之一。

Methoprene是保幼激素的類似物，1986年，Wilson等[85]首次報道了Met（methoprene-tolerant）突變體果蠅對JH抗性研究，發(fā)現(xiàn)過量的JH處理可以誘導果蠅幼蟲生成假瘤（pseudotumor），而Met突變體對這種誘導作用的耐受能力遠強于正常果蠅。2013年Jindra等[82]確定了Met轉(zhuǎn)錄因子是JH的核內(nèi)受體，提示保幼激素主要在細胞核中作用于基因的表達和功能，使得 JH的分子機制被慢慢揭開。進一步研究發(fā)現(xiàn)Met有一個旁系同源基因Gce（Germ cell-expressed）[86]，Gce也是一種bHLH-PAS（basic helix-loop-helix Per-AhR/Arnt-Sim）蛋白，能夠結(jié)合JH[87-89]。昆蟲咽側(cè)體（CA）合成并分泌JH，在血淋巴中形成JH-JHBP聚合物，隨著體液循環(huán)，JH-JHBP識別結(jié)合靶細胞，之后JH脫離JHBP進入細胞質(zhì)，與Met結(jié)合激活下游信號[90]。果蠅中存在Gce，當胞質(zhì)內(nèi)JH濃度較低時，Met聚合為同源二聚體Met-Met 或者異源二聚體Met-Gce，當胞質(zhì)內(nèi)JH 濃度較高時，JH與Met 結(jié)合，導致Met-Met/Met-Gce解離[88,91,92]，隨后Met結(jié)合SRC（steroid receptor coactivator）或FISC（βFtz-F1 interacting steroid receptor coactivator）等形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體Met/SRC或Met/FISC 結(jié)合到下游基因JH反應(yīng)元件JHRR（位于Kr-h1 啟動子區(qū)域，包含3個E-box-like序列）區(qū)域，調(diào)控Kr-h1（Krüppel-homolog1）的表達[84,93-95]，保幼激素級聯(lián)調(diào)控的模式如圖 3[96]。Kr-h1作為JH 信號通路中下游關(guān)鍵應(yīng)答基因，編碼含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控JH的合成。Kr-h1通過受體Met和Gce傳遞保幼激素信號，維持幼蟲狀態(tài)，調(diào)控幼蟲的生長發(fā)育與變態(tài)，通過注射dsRNA降低梨小食心蟲Grapholita molesta GmMet和GmKr-h1的表達，結(jié)果出現(xiàn)幼蟲的存活率顯著降低、蛹畸形以及存活成蟲的繁殖力降低的現(xiàn)象[56]。GmMet和GmKr-h1的氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲，特別是棉鈴蟲Helicoverpa armigeraHübner具有高度同源性，同時JH在發(fā)育、變態(tài)和繁殖中的功能在完全變態(tài)和不完全變態(tài)的昆蟲中的進化中都是保守的，因此JH信號通路為害蟲dsRNA防控提供了合適的靶標位點[56,82]。Tai（Taiman）也是bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，Met/Tai異源二聚體介導JH信號，觸發(fā)Kr-h1，調(diào)節(jié)幼蟲發(fā)育，防止早熟[97]。對德國小蠊Blattella germanica[98]和始紅蝽Pyrrhocoris apterus[99]中的Tai進行RNAi，結(jié)果導致幼蟲100%的死亡率。在赤擬谷盜Tribolium castaneum[100]和果蠅Drosophila melanogaster[92]的試驗中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。在馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata三齡幼蟲體內(nèi)連續(xù)注射Tai-dsRNA可導致約20%的幼蟲死亡率和80%的化蛹失敗率，因此Tai在JH通路中發(fā)揮重要作用，也是一個潛在的RNAi基因[101,102]。

圖3 保幼激素級聯(lián)調(diào)控[96]Fig. 3 Juvenile hormone cascade regulation diagram[96]

2.2 基于納米載體的RNAi應(yīng)用

傳統(tǒng)的 dsRNA遞送技術(shù)包括顯微注射、轉(zhuǎn)基因植物、飼喂或浸泡。顯微注射可以避免表皮或腸道上皮的屏障作用，將dsRNA精確地遞送到靶細胞處，通過注射方法在番茄潛葉蛾中驗證了潛在的RNAi的靶基因[39]，但是此方法僅適用于RNAi靶基因的功能分析，卻不能在田間進行推廣應(yīng)用。植物介導的轉(zhuǎn)基因植物，如轉(zhuǎn)基因玉米，在害蟲防控方面取得了突破性進展，但是需要在多種谷物中開發(fā)葉綠體轉(zhuǎn)化協(xié)議，擴大轉(zhuǎn)基因技術(shù)的作物范圍，且大多數(shù)國家仍將轉(zhuǎn)基因作物視為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，由于其潛在的環(huán)境風險，需要對其進行嚴格的評估[28]。與植物介導的dsRNA傳遞相比，非轉(zhuǎn)化傳遞策略因其時間短、開發(fā)成本低、抗性風險低、調(diào)控過程簡單、對所有作物都具有可行性而受到青睞[103]。

dsRNA在體內(nèi)表皮的穿透能力和穩(wěn)定性有限，因此需要進一步提高其穿透效率和穩(wěn)定性，進而提高對靶標的干擾效率，以滿足害蟲防治的實際需要。目前在提高 dsRNA穩(wěn)定性方面的研究主要集中在脂質(zhì)體或納米粒子對 dsRNA進行包裹以保護其不被消化系統(tǒng)內(nèi)的各種酶降解[28,104,105]。納米顆粒介導的 dsRNA遞送系統(tǒng)在提高RNAi效率方面具有突出的優(yōu)勢[28,106-109]。在大多數(shù)情況下，納米顆粒的陽離子基團可通過靜電相互作用與dsRNA的磷酸基團結(jié)合形成dsRNA/納米顆粒復(fù)合物[110,111]。陽離子核殼型熒光納米顆粒（cationic core-shell fluorescent nanoparticles，F(xiàn)NP）、支化兩親肽膠囊——BAPCs（Branched Amphiphilic Peptide Capsules）和殼聚糖（chitosan，CS）等已成功應(yīng)用于生物工程dsRNA研究領(lǐng)域[28]。其中殼聚糖是一種天然的高分子材料，來源于海洋生物[112]，具有良好的安全性、生物相容性和生物可降解性等特點，CS 分子中帶正電荷的葡糖胺基可與帶負電荷的DNA、dsRNA等產(chǎn)生靜電作用，形成較為穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，它作為一種極有前途的 dsRNA、siRNA、質(zhì)粒 DNA、寡核苷酸、多肽甚至蛋白質(zhì)的遞送系統(tǒng)而受到人們的關(guān)注[113-118]。

近十幾年來，納米技術(shù)迅速發(fā)展，并且廣泛滲透于各個學科領(lǐng)域，形成了一系列既相對獨立又互相聯(lián)系的分支學科。納米材料是指在三維空間中，至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm）或者由它們作為基本單元所構(gòu)成的材料，尺度大概相當于 10～100個原子緊密地排列在一起[119]。納米材料由于較小的尺寸，較大的比表面積，優(yōu)異的光學、力學、電學、磁學及化學反應(yīng)性能，使其應(yīng)用研究正在半導體芯片、癌癥診斷、光學新材料和生物分子追蹤等領(lǐng)域高速發(fā)展[120,121]，被譽為21世紀最有前途的材料，并在生物學和醫(yī)學領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[122]。納米顆粒載導的dsRNA/siRNA的傳遞過程主要包括納米顆粒與核酸的結(jié)合或納米顆粒將核酸包裹、細胞的攝取、內(nèi)涵體逃逸、以及核酸釋放或納米復(fù)合物的降解四個步驟。其具體過程為納米顆粒的陽離子基團可以通過靜電相互作用與dsRNA的磷酸基團結(jié)合形成dsRNA/納米顆粒復(fù)合物，當昆蟲攝入后，dsRNA/納米顆粒復(fù)合物先與細胞膜結(jié)合，然后通過內(nèi)吞作用進入細胞。在細胞攝取復(fù)合物后，會形成一個包含復(fù)合物的小泡，該小泡沿著微管移動到達內(nèi)涵體，陽離子聚合物能夠保護dsRNA/siRNA，避免其被核酸酶降解，最終dsRNA/siRNA從內(nèi)涵體中釋放出來并在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，如圖3所示[28]。

納米顆粒介導的RNAi在許多昆蟲中得到了成功應(yīng)用[28]。2013年，He等[107]報道了一種陽離子核殼型熒光納米顆粒（cationic core-shell fluorescent nanoparticle (FNP)），他們以亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis為研究對象，讓幼蟲取食含有FNP/CHT10-dsRNA混合物的飼料，進而成功抑制幾丁質(zhì)酶基因CHT10的表達，該結(jié)果表明FNP可作為一種高效的基因載體，能成功載導dsRNA抑制關(guān)鍵靶基因的表達，阻礙幼蟲的生長發(fā)育，進而起到防控害蟲的效果。這是首例通過納米熒光顆粒載導dsRNA應(yīng)用于害蟲的研究。自此后，納米載體載導 dsRNA在不同的害蟲中均有成功應(yīng)用的報道。Zhang等[115]的研究表明，幼蟲攝取了chitosan/interfering RNA納米顆粒與食物結(jié)合的混合物后，成功地抑制岡比亞按蚊Anopheles gambiae和埃及伊蚊Aedes aegypti幼蟲的多個基因表達，進一步qRT-PCR或原位雜交證明，喂養(yǎng)幼蟲后，對相關(guān)基因的抑制至少可以持續(xù)到蛹晚期。此試驗驗證了殼聚糖納米顆?？捎糜赿sRNA及siRNA的遞送的有效性，殼聚糖因其成本低、無毒、可生物降解等優(yōu)勢，可以作為害蟲防治的優(yōu)質(zhì)材料，擁有廣闊的應(yīng)用前景。德國小蠊對dsRNA的注射高度敏感，通過RNAi可有效抑制相關(guān)基因的表達，因此充分利用這一特征可對其進行有效防控，通過脂質(zhì)體包裹dsRNA以延緩其在中腸內(nèi)的降解，試驗結(jié)果顯示飼喂脂質(zhì)體包裹的dsRNA后，德國小蠊α-tubulin基因的表達被抑制，導致死亡[123,124]。Avila等[125]運用一種全肽納米材料——BAPCs（Branched Amphiphilic Peptide Capsules）結(jié)合dsRNA飼喂豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和赤擬谷盜Tribolium castaneum，與攝入相同量的BiP-dsRNA相比，食用BiP-dsRNA與BAPCs復(fù)合物可導致豌豆蚜幼蟲過早的死亡；采用BiP-dsRNA和Armet-dsRNA與BAPCs復(fù)合物可有效殺死赤擬谷盜，大多數(shù)（約75%）在幼蟲期或羽化期死亡，單獨喂養(yǎng)dsRNA死亡率較低（約30%）。此結(jié)果顯示通過與納米材料的有效結(jié)合，可以提高dsRNA的干擾效率。Parsons等[108]在草地貪夜蛾中測試了一種合成的鳥苷酸聚合物（poly-[N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide]，(pGPMA)），發(fā)現(xiàn) Polymer-dsRNA interpolyelectrolyte complexes（IPECs）能夠有效地被細胞吸收，觸發(fā)RNAi，并驅(qū)動高效的基因抑制，抑制效率可達80%，進而致使昆蟲的死亡率達35%。Christiaens等[126]使用鳥苷酸聚合物作為載體可防止dsRNA被鱗翅目昆蟲堿性腸溶液降解，飼喂甜菜夜蛾Spodoptera exigua納米顆粒dsRNA復(fù)合物后，可有效干擾幾丁質(zhì)合成酶B（chitin synthase B，ChSB）基因，使得該害蟲的死亡率從16%提升到了53% 。Zheng等[127]在大豆蚜Aphis glycines上建立了一種納米材料介導的dsRNA體壁滲透系統(tǒng)，在大豆蚜體壁上噴灑該復(fù)合物獲得了95.4%的RNAi效率和80.5%的種群抑制效應(yīng)。Yan等[128]在前期研究的基礎(chǔ)上以星形陽離子聚合物為載體，通過局部施用和噴灑的方式使得dsRNA有效穿過大豆蚜Aphis glycines的體壁，其死亡率分別達到了81.67%和78.5%。以上成功的試驗案例可以看出RNAi作為重要的研究工具通過與納米載體結(jié)合為害蟲防治提供了新的前景，尤其在鱗翅目昆蟲中可通過納米載體提高干擾效率。基于Yan等[28]的綜述，對近幾年來納米粒子介導的RNAi技術(shù)在重要害蟲中的研究及應(yīng)用進行了補充和總結(jié)，詳見表1。

表1 納米粒子介導的 RNA干擾（RNAi）在昆蟲中的成功應(yīng)用Table 1 Successful applications of nanoparticle-mediated RNA interference (RNAi) in insects

圖4 納米顆粒介導的雙鏈RNA/小分子RNA（dsRNA/siRNA）傳遞系統(tǒng)示意圖[28]Fig. 4 Schematic representation of nanoparticle-mediated double-stranded RNA/small interfering RNA (dsRNA/siRNA) delivery system[28]

3 基于工程菌高效合成靶向昆蟲的dsRNA

利用RNAi技術(shù)在農(nóng)業(yè)害蟲防控方面研究已經(jīng)取得了一定進展，但目前RNAi技術(shù)在田間應(yīng)用的主要限制因素是 dsRNA的合成成本過高，因此不利于產(chǎn)品的推廣。中國農(nóng)業(yè)大學沈杰教授的研究團隊利用L4440 質(zhì)粒和大腸桿菌HT115(DE3)菌株，建立了一種經(jīng)濟、高效的昆蟲靶標基因dsRNA合成方法。該團隊以異色瓢蟲Harmonia axyridis(Pallas)vestigial為試驗對象通過構(gòu)建有目的基因片段的RNAi載體，利用IPTG誘導大腸桿菌HT115（DE3）表達合成vg-dsRNA，vg-L4440 重組表達載體的構(gòu)建以及vg-dsRNA誘導過程如圖5所示，與商業(yè)化的dsRNA合成試劑盒相比，工程菌合成dsRNA的方法大幅降低了dsRNA 的合成成本[145]。通過將dsRNA與納米載體結(jié)合，保護其進入昆蟲體內(nèi)不被核酸酶降解，從而產(chǎn)生RNAi，以達到綠色、安全、高效的害蟲防控目標。最近該團隊通過去除大腸桿菌BL21（DE3）中的編碼核糖核酸內(nèi)切酶RNase III的rnc基因，并與含有單一T7啟動子的RNAi表達載體進行連接，構(gòu)建了一種新型的pET28-BL2（DE3）RNase III系統(tǒng)，其表達效率是L4440-HT115（DE3）的3倍，該系統(tǒng)為大規(guī)模生產(chǎn)dsRNA提供了一種低成本、高效率的新方法，將會更好地促進基因功能分析以及基于RNAi害蟲防治的發(fā)展[146]。

圖5 Vg-L4440 重組表達載體的構(gòu)建以及vg-dsRNA 誘導過程[145]Fig. 5 Construction of Vg-L4440 recombinant expression vector and vg-dsRNA induction process

4 展望

每年害蟲擴散和暴發(fā)引起的農(nóng)作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降而導致的經(jīng)濟損失巨大，因此對農(nóng)業(yè)害蟲的防控不容忽視，同時，抗藥性、殘留、污染等問題備受關(guān)注，因此需選擇綠色、安全、高效的防控措施進行防控。RNAi是近幾年來迅速發(fā)展的一項抑制基因表達的技術(shù)，在基因治療和害蟲的遺傳學控制方面表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用潛能，同時也是一種潛在的防治害蟲的工具，而利用RNAi進行有效的害蟲防治的最大挑戰(zhàn)是開發(fā)高效可靠的dsRNA生產(chǎn)和遞送技術(shù)。以納米粒子為載體，可有效防止dsRNA在昆蟲體內(nèi)被核酸酶降解，保護 dsRNA安全到達靶標位點后有效釋放并發(fā)揮 RNAi作用，同時工程菌高效合成靶向昆蟲dsRNA的方法，降低了dsRNA的合成成本，為dsRNA的大量合成提供了技術(shù)支撐，推動了RNAi核心技術(shù)在害蟲防治方面的新發(fā)展，最終可通過葉面噴灑、根灌、樹干注射等[147]多種方式進行推廣應(yīng)用，充分發(fā)揮RNA干擾的效應(yīng)。本文對采用納米載導dsRNA技術(shù)進行害蟲防控的相關(guān)研究及應(yīng)用進行了綜述，以期為害蟲防控提供新的思路，達到有效的防控效果，減少害蟲暴發(fā)造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失，保證農(nóng)作物的安全生產(chǎn)。