劉品，王文博，羅然丹，魯瑛，呂潔心

（咸陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

大口黑鱸（Micropterus salmoides），俗稱加州鱸，為肉食性魚類，原產(chǎn)美國(guó)加利福尼亞州密西西比河水系。由于其生長(zhǎng)迅速、肉質(zhì)鮮美、抗病力強(qiáng)、適溫性廣等特點(diǎn)，現(xiàn)已推廣全國(guó)各地，成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。據(jù)2019 年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，我國(guó)2018 年鱸魚海水養(yǎng)殖產(chǎn)量為166 000 t，淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為432 000 t[1]。近幾年，隨著馴化養(yǎng)殖技術(shù)的提高，可實(shí)現(xiàn)大口黑鱸養(yǎng)殖不投喂冰鮮魚，全程使用配合飼料。然而，大口黑鱸合成高不飽和脂肪酸的能力有限，需要在飼料中添加魚油等富含高不飽和脂肪酸的油脂[2]。而不飽和脂肪酸極易受到光、熱和金屬離子等因素的誘導(dǎo)而氧化變質(zhì)。飼料中脂肪的氧化不僅可削弱其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還會(huì)影響飼料風(fēng)味，降低魚類的生長(zhǎng)性能和飼料利用效率，引起魚體氧化應(yīng)激從而造成病害的發(fā)生[3-5]。

在飼料中添加抗氧化劑可以有效改善動(dòng)物體的氧化應(yīng)激狀況，是一種通過(guò)日常飼喂來(lái)預(yù)防疾病的有效策略。硫辛酸是一種具有強(qiáng)抗氧化性能的天然化合物，能夠直接清除眾多活性氧自由基（Reactive oxygen species, ROS）；此外可作為金屬螯合劑減輕重金屬離子對(duì)機(jī)體的氧化損傷；還能參與體內(nèi)其他抗氧化劑的再生，因而被譽(yù)為“萬(wàn)能抗氧化劑”[6]。近年來(lái)，硫辛酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的作用研究逐漸增多，目前已發(fā)現(xiàn)硫辛酸對(duì)鯰魚[7]、皺紋盤鮑[8]、羅非魚[9]、鯧鲹[10]、鯉魚[11]、草魚[12]和南美白對(duì)蝦[13]等水生動(dòng)物具有增強(qiáng)抗氧化性能的作用。

當(dāng)前，關(guān)于硫辛酸對(duì)大口黑鱸氧化應(yīng)激的影響鮮有報(bào)道。該試驗(yàn)在已有研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)大口黑鱸腹腔注射不同濃度硫辛酸（20 mg/kg 和40 mg/kg），研究硫辛酸對(duì)血清及肝臟抗氧化相關(guān)酶活性的影響，從而為大口黑鱸飼料中硫辛酸的添加提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

硫辛酸為淡黃色、黃色結(jié)晶性粉末，購(gòu)于西安澤邦生物科技有限公司，含量為99%。硫辛酸先溶解于少量乙醇后，再用0.65%氯化鈉溶液將其稀釋成 2 mg/mL 和 4 mg/mL 注射液?？偟鞍祝═P）、總超氧歧化酶（T-SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)用魚與飼養(yǎng)管理

大口黑鱸購(gòu)自西安草灘漁場(chǎng)，用3% 氯化鈉浸泡消毒10~15 min 后放入預(yù)先消毒的水箱（30L）內(nèi)。正式試驗(yàn)前飼養(yǎng)馴化兩周。飼養(yǎng)期間每天9：00、13：00、17：00 對(duì)其進(jìn)行投食，每次投喂 30 min，觀察記錄魚的進(jìn)食情況與生長(zhǎng)狀況。

1.3 試驗(yàn)分組

正式試驗(yàn)前24 h 停止飼喂，選取體質(zhì)量為（17±0.25）g 的健康大口黑鱸 60 尾，經(jīng) 3% 的氯化鈉浸泡消毒后隨機(jī)分為對(duì)照組（按體質(zhì)量注射0.65%的氯化鈉）、T20組（依體質(zhì)量注射，硫辛酸終量為20 mg/kg）和T40組（依體質(zhì)量注射，硫辛酸終量為40 mg/kg），最終使各組相同體重的魚注射液體量一致。每組20 尾，隨機(jī)放入對(duì)應(yīng)養(yǎng)殖水箱中，保證每組魚均重大致相等。

1.4 樣品采集

完成試驗(yàn)魚腹腔注射后，分別于注射后的6 h、12 h、24 h 取樣，每次取樣 6 尾，50 mg/L 的 MS-222溶液麻醉，之后用2 mL 注射器于試驗(yàn)魚尾椎靜脈采集血液，每組抽取兩尾魚的血液混合得到一個(gè)樣品，在4 ℃環(huán)境中靜置4 h 以上，然后3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。完成魚體抽血后進(jìn)行解剖，分離肝臟，稱重后按照1∶9 的體積比加入生理鹽水，在冰浴中勻漿后3 000 r/min 離心10 min，分離上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 酶活性檢測(cè)

肝臟總蛋白含量（TP）、總超氧歧化酶（T-SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性以及血清過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對(duì)所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件中的Oneway ANOVA 程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，使用Duncans 多重比較分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性，顯著水平為P<0.05，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 硫辛酸對(duì)大口黑鱸血清活性的影響

由表1 可見，大口黑鱸注射硫辛酸6 h 后，硫辛酸注射組（T20和T40）血清中CAT 酶活性均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），硫辛酸處理組組間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；注射硫辛酸 12 h 后，T40組 CAT酶活性最高，T20組次之，均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；24 h 后，各組間CAT 酶活性無(wú)差異。此外T20和T40組CAT 酶活性都隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，說(shuō)明腹腔注射硫辛酸可顯著提高大口黑鱸血清CAT 酶活性，且有時(shí)間與劑量依賴性。

表1 硫辛酸對(duì)于大口黑鱸血清CAT 活性影響 U/mL

2.2 硫辛酸對(duì)大口黑鱸肝臟CAT 及T-SOD 酶活性的影響

由表2 可以知，腹腔注射6 h 后，硫辛酸處理組肝臟的CAT 酶活性與對(duì)照組相比沒有差異（P>0.05）；注射 12 h 后至 24 h，T40組 CAT 酶活性顯著高于 T20與對(duì)照組（P<0.05），T20組與對(duì)照組間無(wú)差異（P>0.05）。T20和T40組CAT 酶活性都隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，對(duì)照組則呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，說(shuō)明腹腔注射硫辛酸可顯著提高大口黑鱸肝臟CAT 酶活性，且有時(shí)間與劑量依賴性。

大口黑鱸腹腔注射硫辛酸后肝臟T-SOD 酶活性變化如表3 所示，與對(duì)照組相比，T20組肝臟T-SOD酶活性在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著增強(qiáng)（P<0.05），T40組肝臟 T-SOD 酶活性在 12 h 內(nèi)顯著升高（P< 0.05），且T20組酶活性顯著高于 T40組（P<0.05）。此外，對(duì)照組肝臟T-SOD 酶活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，與之相反，硫辛酸處理組肝臟T-SOD 酶活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。說(shuō)明腹腔注射硫辛酸可顯著提高大口黑鱸肝臟T-SOD 酶活性，但是該促進(jìn)作用隨著時(shí)間和劑量的增大而減弱。

表2 硫辛酸對(duì)大口黑鱸肝臟CAT 活性影響 U/mgprot

表3 硫辛酸對(duì)大口黑鱸肝臟T-SOD 活性的影響 U/mgprot

3 討論

動(dòng)物體內(nèi)的氧化系統(tǒng)與抗氧化防御系統(tǒng)在正常生理情況下是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)會(huì)發(fā)生改變導(dǎo)致功能異常，產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）[14]。低水平的 ROS 可通過(guò)磷酸酶或磷酸激酶參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，維持細(xì)胞的正常生理功能，高水平的ROS 則容易攻擊細(xì)胞內(nèi)重要的生物分子如脂類、蛋白質(zhì)和核酸等，引發(fā)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激[15]。為了降低ROS 引起的氧化損害，機(jī)體內(nèi)存在多種降低ROS 的酶促和非酶促抗氧化酶體系來(lái)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。酶促抗氧化劑包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase,CAT）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase, GR）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPx）等，它們能促進(jìn)ROS 降解、能結(jié)合催化ROS 生成的金屬（如鐵和銅）；非酶抗氧化劑需要在飼料中添加抗壞血酸、α-生育酚、類胡蘿卜素、維生素E 和硫辛酸等[16-18]?？寡趸瘎┩ǔＶ饕ㄟ^(guò)防止活性氧自由基（ROS）的產(chǎn)生或清除形成的ROS 來(lái)發(fā)揮其作用。這些抗氧化劑協(xié)同作用，共同維持機(jī)體的ROS 平衡。

硫辛酸由于其強(qiáng)抗氧化性越來(lái)越受到關(guān)注，不僅可以增強(qiáng)生物體的抗氧化性能，還可以作為眾多信號(hào)通路的有效激活劑參與機(jī)體的多種生化調(diào)控。硫辛酸分子中有一個(gè)二硫鍵，硫辛酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部其二硫鍵即被多種酶還原，生成二氫硫辛酸（DHLA），變成硫辛酸的還原形式。DHLA 可以促進(jìn)其他抗氧化劑的再生，如α-生育酚、抗壞血酸和谷胱甘肽等[19-20]。由于這些特性，硫辛酸可用于改善細(xì)胞的抗氧化狀態(tài)。此外，硫辛酸兼具水溶性和脂溶性，在動(dòng)物體內(nèi)被腸道吸收后極易進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物功能。資料顯示硫辛酸可以增強(qiáng)多種動(dòng)物的抗氧化性能，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的影響[21-23]。對(duì)哺乳動(dòng)物及人的研究還發(fā)現(xiàn)硫辛酸在糖尿病、阿爾茨海默氏癥、急性腎衰竭和癌癥等疾病的輔助治療方面可發(fā)揮積極作用[20，24-25]。

近年來(lái)，學(xué)界開始研究硫辛酸作為強(qiáng)抗氧化劑對(duì)水生動(dòng)物的作用。硫辛酸可以顯著提高多種水生動(dòng)物體內(nèi)不同組織中抗氧化酶活性及非酶抗氧化劑的含量，如 SOD、GPx、CAT 和 GR 等[12，26-27]。Enamorado 等發(fā)現(xiàn)硫辛酸可顯著提高鯉魚肝臟、腸道和肌肉的還原型谷胱甘肽的含量[11]。在銀鯧鲹的飼料中添加硫辛酸還可以降低其肌肉的脂質(zhì)過(guò)氧化情況，且提高了其腦部的抗氧化狀態(tài)[10]。Shi 等研究發(fā)現(xiàn)硫辛酸可緩解草魚體內(nèi)高不飽和脂肪酸的過(guò)氧化狀態(tài)，并促進(jìn)了非氧化狀態(tài)的高不飽和脂肪酸在草魚體內(nèi)沉積[12]。也有研究者提出通過(guò)腹腔注射硫辛酸的方式預(yù)防藍(lán)藻毒素等環(huán)境因素對(duì)魚類的毒性作用[28]。經(jīng)腹腔注射硫辛酸的處理已被證明是魚類中抗氧化劑施用的另一種途徑[28-29]。由于動(dòng)物體腹膜面積大，密布血管和淋巴管，吸收能力強(qiáng)，對(duì)外源物質(zhì)更容易吸收利用?；诖?，該研究采用腹腔注射的方式給大口黑鱸幼魚提供硫辛酸。

酶促抗氧化系中的總超氧化物歧化酶（T-SOD）是一種天然存在于機(jī)體內(nèi)部的超氧自由基清除因子，它可以將有害的O2-轉(zhuǎn)化為H2O2[30]。因此，SOD經(jīng)常被作為測(cè)定抗氧化劑抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)。大量研究表明，在飼料中添加硫辛酸能顯著提高動(dòng)物體肝臟 SOD 酶活性[8，12，30]。對(duì)豬的研究發(fā)現(xiàn)，高脂日糧中添加硫辛酸顯著促進(jìn)了其肝臟SOD 酶活性[31]。對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，Zhang 等報(bào)道皺紋盤鮑日糧中添加硫辛酸顯著促進(jìn)了肝胰臟中SOD 的酶活，并且降低了鮑魚體液中脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量[8]。Shi 等在草魚飼料中添加硫辛酸顯著促進(jìn)了肝臟組織中SOD 酶活性[12]。Xu 等研究發(fā)現(xiàn)，飼料硫辛酸在低脂質(zhì)水平可顯著促進(jìn)中華絨螯蟹肝臟SOD 酶活性[32]。該試驗(yàn)也同樣發(fā)現(xiàn)，注射硫辛酸后大口黑鱸肝臟T-SOD 酶活性顯著提高，與其他動(dòng)物的研究結(jié)果一致。另外，T-SOD 酶活性隨著處理時(shí)間和劑量的增大而減弱，這與Zhang 等研究皺紋盤鮑的情況類似。皺紋盤鮑飼料硫辛酸添加量低于800 mg/kg 時(shí)，肝臟SOD 酶活性顯著升高，硫辛酸濃度過(guò)高時(shí)SOD 酶活性不受影響[8]。但是在中華絨螯蟹中，飼料中低水平的硫辛酸對(duì)肝臟SOD 酶活性沒有影響，高水平的硫辛酸才能促進(jìn)SOD 酶活性。該試驗(yàn)研究結(jié)果說(shuō)明硫辛酸可以提高大口黑鱸肝臟SOD 酶活力，進(jìn)而影響魚體的抗氧化能力，但是有劑量效應(yīng)。硫辛酸作為抗氧化劑被添加進(jìn)大口黑鱸飼料中需注意添加量。

過(guò)氧化氫酶（CAT）在機(jī)體抗氧化防御中也扮演著重要角色，它可以將 H2O2轉(zhuǎn)化為O2和水，從而使細(xì)胞免受過(guò)氧化氫的損害[31]。在該試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比腹腔注射硫辛酸后大口黑鱸血清中CAT 活性在注射后12 h 內(nèi)顯著升高，且CAT 活性隨著注射硫辛酸濃度的增加而增強(qiáng)。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)硫辛酸注射組（T20和T40）血清CAT 酶活性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。說(shuō)明硫辛酸對(duì)大口黑鱸血清CAT的影響有明顯的時(shí)間和劑量依賴性。研究者在奶牛日糧中添加硫辛酸，發(fā)現(xiàn)奶牛血清CAT 酶活性也有隨時(shí)間和劑量的變化而變化的情況[33]。王定發(fā)等發(fā)現(xiàn)羔羊飼料中添加硫辛酸可以促進(jìn)其血清CAT 酶活性[34]。該研究還發(fā)現(xiàn)不同于血清CAT 酶活性變化規(guī)律，肝臟中僅高濃度硫辛酸組（T40）CAT 酶活性顯著升高，且是在處理12 h 以后。說(shuō)明肝臟CAT 酶活對(duì)硫辛酸的反應(yīng)慢于血液循環(huán)系統(tǒng)，而且肝臟中CAT 酶活性對(duì)硫辛酸敏感性低。陳齊勇等在皺紋盤鮑中發(fā)現(xiàn)飼料中添加硫辛酸對(duì)其肝臟CAT 酶活性沒有影響[35]。而Shi 等在草魚中發(fā)現(xiàn)飼料中的硫辛酸提高了草魚肝胰臟中CAT 酶活力，但并未影響血清中CAT 活性[12]。相對(duì)于飼養(yǎng)試驗(yàn)，該試驗(yàn)采用腹腔注射的方式給大口黑鱸提供硫辛酸，機(jī)體更容易吸收利用。硫辛酸通過(guò)腹腔注射的方式首先進(jìn)入血液，然后是肝臟。所以血清CAT 酶活性受硫辛酸影響呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間相關(guān)性，但是肝臟的CAT 酶活性受到硫辛酸的影響相對(duì)滯后。而肝臟T-SOD 酶活性對(duì)硫辛酸更為敏感，在低濃度T20組即表現(xiàn)出較高的活性。硫辛酸對(duì)抗氧化酶活性的影響在不同動(dòng)物中的研究結(jié)果存在一定差異。原因可能與試驗(yàn)方法以及試驗(yàn)對(duì)象有關(guān)。有關(guān)硫辛酸與魚類抗氧化酶之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié)論

硫辛酸作為一種功能強(qiáng)大的抗氧化劑，在動(dòng)物養(yǎng)殖中用于預(yù)防和治療氧化應(yīng)激性疾病或損傷的抗氧化功能已經(jīng)得到了證實(shí)。與其他抗氧化劑類似，硫辛酸可用于改善生長(zhǎng)、提高存活率、促進(jìn)免疫反應(yīng)以及對(duì)污染物侵害的抵抗力，并有助于提高魚類的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在該研究中，硫辛酸對(duì)大口黑鱸血清和肝臟抗氧化酶的活性影響顯示出不同的效果，主要取決于硫辛酸注射劑量和分析的組織器官。研究結(jié)果表明硫辛酸可以通過(guò)促進(jìn)抗氧化酶的活性改善大口黑鱸的抗氧化應(yīng)激能力。下一步有必要研究大口黑鱸中硫辛酸的使用劑量與抗氧化能力之間的關(guān)系，確定硫辛酸在大口黑鱸養(yǎng)殖飼料中的添加量，以使其抗氧化能力方面的作用最大化，其他不利影響最小化。