孫長(zhǎng)花，于智勇，丁娟芳，劉妮婷

(1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院，揚(yáng)州 225009 2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

隨著生活水平不斷提高，人們對(duì)食品安全也越來越關(guān)注，迫切希望用更自然、更安全的天然防腐劑來延長(zhǎng)食品保藏期，從而保證人體健康。近幾年，天然植物源食品防腐劑由于其安全、高效的特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[1-2]。天然食用香辛料因具有抑菌[3]、抗氧化[4-5]作用，對(duì)其防腐保鮮的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)[6]。丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)是一種常見的香料，是桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)科植物丁香的干燥花蕾。丁香能夠抑制多種霉菌和致腐菌的生長(zhǎng)繁殖，是開發(fā)天然防腐劑的良好來源[7]。丁香中含有揮發(fā)油、多酚、黃酮等多種活性物質(zhì)，其中主要抑菌成分為丁香酚[8-9]。目前，關(guān)于丁香抑菌成分研究主要集中于提取方法和工藝[10-14]，以及在食品防腐保鮮中的應(yīng)用[15-17]，而未見其抑菌穩(wěn)定性的研究報(bào)道。本文旨在對(duì)丁香抑菌成分的提取工藝、提取物的抑菌作用、最小抑菌濃度及影響抑菌穩(wěn)定性的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為丁香作為天然防腐劑原料在食品防腐保鮮中的運(yùn)用提供有益的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli, E)，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis, S)，金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus, A)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis, B)，均由揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；丁香：產(chǎn)地廣東，購(gòu)自揚(yáng)州眾成堂大藥房；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂、酵母粉、牛肉浸膏；無水乙醇、氯化鈉、丙酸、氫氧化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鐵、硫酸亞鐵、濃鹽酸，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、JA2003N電子天平、旭曼多功能粉碎機(jī)、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.3 工藝流程

原料選擇 → 粉碎 → 過篩 → 稱量 → 加乙醇 → 超聲波提取 → 抽濾 → 濾液→ 真空濃縮 → 丁香提取物。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 丁香抑菌成分的提取工藝條件優(yōu)化

采用超聲波提取丁香的抑菌成分，分別選用乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平

1.4.2 抑菌圈測(cè)定

抑菌圈的測(cè)定采用牛津杯法[18-19]。將培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，倒培養(yǎng)皿(10～15 mL培養(yǎng)基)，水平靜置至完全凝固，取供試菌懸液0.1 mL于平板上，再倒入10 mL左右培養(yǎng)基，輕微搖動(dòng)，使其與菌液混合均勻，水平靜置至完全凝固。用鑷子將滅過菌的牛津杯輕放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)平皿中均勻地放置 3只牛津杯。吸取0.25 mL丁香提取物至牛津杯。將培養(yǎng)皿正置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑，設(shè)置無菌水作陰性對(duì)照，并以體積分?jǐn)?shù)為0.5%的山梨酸鉀溶液的抑菌試驗(yàn)作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.3 最小抑菌濃度測(cè)定

采用二倍稀釋法，將丁香提取物(濃度為0.850 0 g/mL)用無菌水稀釋，獲得100%、50%、25%、12.5%、6.25%和3.125%共6個(gè)濃度梯度(提取物濃度分別為0.850 0、0.425 0、0.212 5、0.106 3、0.053 1和0.026 6 g/mL)。吸取1 mL不同濃度的稀釋液，分別加入各無菌平皿，再倒入15～20 mL培養(yǎng)基，充分混合均勻，冷卻凝固。取供試菌懸液0.1 mL與平板上，涂布均勻[20]。將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.4.4 影響丁香提取物抑菌穩(wěn)定性的因素

丁香提取物分別經(jīng)過不同的熱處理、pH值、金屬離子Na+、K+、Ca2+以及紫外照射等條件處理[20-21]，以未處理過的提取物作對(duì)照，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)牛津杯法抑菌圈直徑，研究在食品加工中各種條件對(duì)丁香提取物抑菌穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香抑菌成分的提取工藝條件優(yōu)化

分別將在各提取工藝條件下得到的丁香提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。丁香提取物對(duì)大腸桿菌(E)、金黃色葡萄球菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、表皮葡萄球菌(S)的抑菌效果用抑菌圈直徑大小判斷，具體結(jié)果見表2。

由表2可知，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間的極差R分別為8.6、1.2、5.2和2.9，因此影響丁香抑菌成分提取效果的條件因素的主次順序?yàn)橐掖既芤后w積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間>料液比。其中，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果影響最大，乙醇含量過低，丁香抑菌成分溶出量偏低，抑菌效果不佳。提取溫度較低時(shí)，有效抑菌成分的溶出量低，提取不完全。提取時(shí)間過短，提取不充分，導(dǎo)致抑菌效果不好。料液比對(duì)提取效果的影響相對(duì)較小，當(dāng)提取溶劑量過少，有效成分的提取量也過少，抑菌效果不佳；提取溶劑使用量較大時(shí)，明顯增加提取物的濃縮時(shí)間，導(dǎo)致有效成分提取量的損失，降低抑菌效果。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果K值，篩選出最佳組合A2B2C2D3，即：乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比為1∶10，提取溫度80 ℃，超聲波提取80 min，在此條件下獲得的丁香提取物抑菌效果最好。

表2 丁香中天然抑菌成分提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 丁香提取物的抑菌效果及最小抑菌濃度

2.2.1 丁香提取物的抑菌效果

采用牛津杯法，對(duì)丁香提取物和0.5%山梨酸鉀進(jìn)行金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌等的抑菌試驗(yàn)，抑菌效果見圖1。

圖1 丁香提取物對(duì)常見細(xì)菌的抑菌效果

從圖1可看出，丁香提取物和山梨酸鉀對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌均有明顯的抑菌作用，形成明顯的抑菌圈，并且丁香提取物的抑菌活性明顯高于同在等條件下的0.5%山梨酸鉀。丁香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為15.7 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.9 mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為21.6 mm，對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑為23.3 mm；山梨酸鉀對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為12.8 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為13.6 mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為12.2 mm，對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑為17.1 mm。

2.2.2 丁香提取物的最小抑菌濃度

采用二倍稀釋法，對(duì)丁香提取物(濃度為0.850 0 g/mL)分別進(jìn)行涂布抑菌試驗(yàn)。通過不同稀釋濃度的平皿中菌落生長(zhǎng)情況來判定提取物的最小抑菌濃度，結(jié)果(表3)表明，丁香提取物濃度為0.106 3 g/mL時(shí)，均未見菌落生長(zhǎng)，說明丁香提取物對(duì)常見細(xì)菌的抑菌效果良好。同時(shí)，丁香提取物對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度也不同。當(dāng)丁香提取物濃度稀釋到0.053 1 g/mL時(shí)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均出現(xiàn)菌落，丁香提取物對(duì)3種細(xì)菌的最小抑菌濃度為0.106 3 g/mL；當(dāng)提取物濃度稀釋到0.026 6 g/mL時(shí)，表皮葡萄球菌才有菌落出現(xiàn)，說明丁香提取物對(duì)表皮葡萄球菌有很強(qiáng)的抑菌效果，最小抑菌濃度為0.053 1 g/mL。

表3 丁香提取物的最小抑菌濃度

2.3 丁香提取物抑菌穩(wěn)定性的研究

2.3.1 熱處理對(duì)丁香提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

將丁香提取物分別在80 ℃、100 ℃和121 ℃下處理 30 min，以未處理過的提取物作對(duì)照，對(duì)提取物穩(wěn)定性的影響結(jié)果見圖2。

圖2 熱處理對(duì)丁香提取物抑菌作用的影響

由圖2可知，經(jīng)過不同溫度的熱處理，丁香提取物的抑菌效果變化不顯著。80 ℃和100 ℃熱處理后，丁香提取物對(duì)供試菌的抑菌圈平均直徑分別減?。篍為0.7 mm，A為0.2 mm，B為1.3 mm，S為1.4 mm，減幅小于6%，抑菌效力基本不變；121 ℃處理后，提取物抑菌圈平均直徑分別減小：E為3.0 mm，A為1.4 mm，B為4.7 mm，S為3.3 mm，抑菌效力略降低，但仍有較好的抑菌效果，說明丁香提取物對(duì)熱的穩(wěn)定性較好。

2.3.2 pH值對(duì)丁香提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

分別用丙酸和NaOH溶液將提取物的pH值調(diào)節(jié)為2.0、4.0、8.0和10.0，以未處理過的丁香提取物(pH 6.0)作對(duì)照。抑菌結(jié)果(圖3)顯示，丁香提取物的抑菌效果受pH值的影響，且變化顯著。當(dāng)pH 2.0時(shí)，提取物抑菌圈平均直徑減?。篍為5.8 mm，A為5.1 mm，B為11.0 mm，S為7.3 mm，最高減幅達(dá)50%，抑菌活力降低明顯；當(dāng)pH 4.0時(shí)，提取物的抑菌圈平均直徑減?。篍為0.2 mm，A為0.1 mm，B為1.9 mm，S為0.7 mm，變化幅度低于9%，抑菌活性基本未受影響；當(dāng)pH 8.0時(shí)，提取物抑菌圈平均直徑減?。篍為6.0 mm，A為4.3 mm，B為6.8 mm，S為6.6 mm，抑菌活力降低，抑菌效果變差；當(dāng)pH 10時(shí)，提取物抑菌圈平均直徑減?。篍為7.9 mm，A為7.1 mm，B為14.1 mm，S為10.3 mm，減幅高達(dá)63.6%，抑菌活力顯著降低。因此，丁香提取物在弱酸性及中性環(huán)境下的抑菌穩(wěn)定性很好，但是在強(qiáng)酸性、堿性環(huán)境下抑菌效果較差。

圖3 pH值對(duì)丁香提取物抑菌作用的影響

2.3.3 金屬離子對(duì)丁香提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

分別配制1 mol/L 的不同金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+)的溶液，以未處理過的提取物作對(duì)照。金屬離子對(duì)提取物穩(wěn)定性的影響結(jié)果(圖4)顯示：金屬離子Na+、K+、Ca2+處理后，丁香提取物抑菌圈平均直徑最多減?。篍為1.1 mm，A為1.1 mm，B為1.3 mm，S為1.8 mm，減少量小于7.7%，抑菌活性保持穩(wěn)定；金屬離子Fe2+、Fe3+處理過的提取物，抑菌圈平均直徑分別增加E為3.9 mm、A為4.7 mm、B為1.5 mm，S為2.7 mm，最大增幅29.6%，抑菌活性有一定程度的提高。這個(gè)現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是：1)金屬離子本身具有抑菌作用；2)抑菌成分與金屬離子發(fā)生螯合作用，從而提升了抑菌活力[20]。

圖4 金屬離子對(duì)丁香提取物抑菌作用的影響

2.3.4 紫外線照射對(duì)丁香提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

將丁香提取物分別置于紫外線燈下照射，照射時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20和25 min，以未處理的提取物作對(duì)照。紫外照射對(duì)提取物穩(wěn)定性的影響結(jié)果(圖5)顯示，經(jīng)過紫外線照射處理，隨著照射時(shí)間的變化，丁香提取物抑菌圈平均直徑并未出現(xiàn)明顯變化。與對(duì)照相比，抑菌圈平均直徑的變化最大值分別為：E為2.2 mm，A為1.1 mm，B為3.5 mm，S為2.6 mm，變化幅度小于15.8%，抑菌活性基本保持穩(wěn)定。因此，丁香提取物對(duì)紫外線照射的穩(wěn)定性很好。

圖5 紫外線照射對(duì)丁香提取物抑菌作用的影響

3 討論與結(jié)論

丁香是一種常見的香料，具有抑菌作用。丁香抑菌成分的最佳提取工藝條件為：乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比為1∶10，提取溫度80 ℃，超聲波提取80 min，獲得的丁香提取物對(duì)常見細(xì)菌均具有較好的抑菌效果。丁香提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為0.106 3 g/mL，對(duì)表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度0.053 1 g/mL。

現(xiàn)有的研究報(bào)道表明，丁香的抑菌活性成分主要包括丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯、水楊酸甲酯、苯甲醛、乙酸芐酯等物質(zhì)[10]。對(duì)丁香提取物的抑菌穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，丁香提取物的熱穩(wěn)定性較好，對(duì)紫外線有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，大多數(shù)金屬離子對(duì)其抑菌效果也無明顯作用，在酸性及中性環(huán)境下的抑菌穩(wěn)定性很好，但是在堿性環(huán)境下抑菌活性降低。這說明丁香提取物中某些抑菌成分和溶液中的堿發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致該抑菌成分的抑菌活力降低或消失，該抑菌成分應(yīng)為有機(jī)酸酚類，而丁香的抑菌活性成分中丁香酚屬于有機(jī)酸酚類，因此推斷丁香的主要抑菌成分是丁香酚，這也與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[8-9]。

丁香原料來源廣、易獲得，丁香提取物具有良好的抑菌作用，且對(duì)加工條件具有廣泛的適用性，因此以丁香作為天然防腐劑原料進(jìn)行加工利用并應(yīng)用于食品的防腐保鮮，具有較好的發(fā)展前景。