王 倩，李 莉，王煥然，卞齊豪，翁亞軍，陳俊英

(1. 西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031;2. 西南交通大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

0 引 言

近年來，血液接觸裝置(如心血管支架、血管移植物、人工心臟瓣膜、體外膜氧合器電路以及體外循環(huán)電路等)在臨床上取得了巨大進展，挽救了成千上萬人的生命[1-3]。生物材料是用于開發(fā)和制造血液接觸器件的基礎(chǔ)，對生物材料進行設(shè)計使其功能化能夠改善血液接觸器件的性能。比如，經(jīng)皮植入技術(shù)對生物材料提出了新的要求，這些被植入人體幾個小時，甚至是終身植入的裝置，應(yīng)滿足生物功能性、生物可調(diào)性及生物相容性的要求[4]。盡管生物材料科學(xué)研究取得了巨大進步，但醫(yī)療器械的植入仍面臨諸多挑戰(zhàn)，例如醫(yī)療器械的凝血問題，醫(yī)療器械植入人體與血液接觸，發(fā)生非特異性血漿蛋白吸附，激活血小板，基于纖維蛋白原分子兩端的血小板結(jié)合位點，活化血小板與吸附在材料表面的纖維蛋白原結(jié)合，血小板上存在多個纖維蛋白原受體使其在纖維蛋白原作用下與其他血小板發(fā)生聚集。此外，被激活的血小板會釋放可溶性因子ADP和血栓素，從而刺激循環(huán)血小板形成更大的血小板聚集物。臨床上通常使用抗血小板藥物或抗凝劑來降低血栓形成的風險，這些藥物能夠?qū)崿F(xiàn)抗凝，但會增加患者出血的風險，因此研究者們通過表面修飾抑制植入材料表面非特異性血漿蛋白吸附，但是，降低生物材料對血漿纖維蛋白原的吸附仍不能有效抑制血小板粘附[5]。很長一段時間內(nèi)，永久性血液接觸裝置在很大程度上是不可能實現(xiàn)的，尋找血液兼容的生物材料一直是一個難題[6]。

逐層自組裝是一種利用相反電荷間靜電相互作用制備多層納米材料的方法[7]，通過裝載功能因子，如殼聚糖、透明質(zhì)酸、肝素、生長因子、抗體及DNA等賦予生物材料抗凝、抗粘附、抗菌、促細胞粘附及基因治療等功能[8-11]。但是，通過傳統(tǒng)逐層自組裝技術(shù)制備的納米材料穩(wěn)定性差，且負載的生物因子不能長期有效地發(fā)揮其生物功能。納米材料的出現(xiàn)為血液接觸材料創(chuàng)造了新的機會，研究者已經(jīng)開發(fā)出各種聚合物，包括納米顆粒、球狀膠束、棒狀膠束、蠕蟲狀膠束、納米管以及多聚體等[12]。聚合物膠束作為嵌段共聚物的自組裝體，是一種很有前途的藥物和基因傳遞載體。聚合物膠束具有球形核殼結(jié)構(gòu)，由兩親性嵌段共聚物在水溶液中自組裝形成，疏水核為疏水治療劑的包裹創(chuàng)造了裝載空間，通過隔離進入疏水核增加疏水藥物的溶解度，而親水殼穩(wěn)定膠束，抑制聚集，減少水解、酶解以及腎清除從而延長其在血液中的循環(huán)時間[13]。Fatemeh等[14]通過兩步法提高鎳鈦合金的血液相容性和耐腐蝕性，將殼聚糖-肝素納米顆粒涂覆于陽極氧化后的鎳鈦合金表面。研究表明，殼聚糖-肝素納米顆粒涂層抑制鎳離子的釋放，同時，納米顆粒涂層控制肝素的釋放從而顯著改善血液相容性。膠束由于其在各領(lǐng)域的巨大貢獻引起了人們的關(guān)注，特別是在其用于藥物遞送領(lǐng)域。膠束不僅可以保護生物活性成分不受到外界環(huán)境的干擾，同時還提高藥物的穩(wěn)定性，將藥物靶向遞送到病灶部位，實現(xiàn)藥物的可控釋放，減少藥物的毒副作用。越來越多的天然和合成材料用于膠束的制備，殼聚糖是一種天然聚合物，具有生物活性、生物可降解性和生物相容性，其在水溶液中帶正電荷，具有很強的靜電相互作用，能夠與三聚磷酸鈉在水溶液中自組裝形成CS-TPP膠束[15]。CS-TPP對人肝癌細胞系BEL7402的體內(nèi)外抗腫瘤作用優(yōu)于殼聚糖分子[16]。Jayakumar等人[17]也對CS-TPP對紫杉醇的負載作用進行了評估，發(fā)現(xiàn)它們有效降低了紫杉醇的毒副作用同時保持了其抗腫瘤活性。牛血清白蛋白作為一種無毒、無免疫原性、低成本、生物相容性良好和可生物降解的內(nèi)源性物質(zhì)而受到廣泛關(guān)注，其具有形成凝膠和乳液的獨特功能特性，是生物活性化合物的首選包封劑[18]。殼聚糖和牛血清白蛋白都是理想的給藥系統(tǒng)，通過控制制備的條件，如pH、離子強度、溫度以及蛋白質(zhì)和多糖的濃度等可以調(diào)控蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用，以此得到不同粒徑的膠束[19]。已有研究證實由殼聚糖和白蛋白等天然聚合物自組裝形成的膠束可用于生物活性化合物的包封和釋放[20]。目前殼聚糖和白蛋白自組裝制備膠束多是用于抗癌藥物的遞送，尚未出現(xiàn)這種膠束對材料進行改性的報道。

本研究通過改變反應(yīng)物濃度、pH等反應(yīng)條件，將殼聚糖、三聚磷酸鈉和牛血清白蛋白進行了大量的自組裝實驗，最終獲得了CS-TPP-BSA膠束，通過材料學(xué)表征測定膠束的尺寸、電位、形態(tài)與結(jié)構(gòu)等，通過多巴胺將膠束結(jié)合到材料表面，探究膠束改性前后材料對血小板黏附、溶血及血栓形成的影響，為CS-TPP-BSA膠束在改善生物材料的血液相容性方面提供了新的思路。

1 實 驗

1.1 材料與設(shè)備

殼聚糖(CS，aladdin)，三聚磷酸鈉(TPP，aladdin)，牛血清白蛋白(BSA，aladdin)，冰醋酸，0.1 mol/L HCL(自配)，0.1 mol/L NaOH(自配)，0.9%NaCl生理鹽水(科倫)，去離子水(aladdin)等。pH計、磁力攪拌器、馬爾文激光粒度儀、Quanta 200型場發(fā)射掃描電子顯微鏡、JEM-2100F場發(fā)射透射電鏡、接觸角測試儀 DSA100 (Krüss，Hamburg，Germany)、傅里葉變換紅外光譜、酶標儀、倒置熒光顯微鏡、恒溫水浴鍋、冷凍干燥機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 CS-TPP-BSA納米膠束的制備

將殼聚糖加入0.5%(質(zhì)量分數(shù))的冰醋酸溶液中攪拌3 h，配制成1 mg/mL的殼聚糖溶液，使用0.1 NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為5.00，將TPP加入UP水中溶解，配制成1 mg/mL的TPP溶液，使用0.1HCL調(diào)節(jié)溶液pH為5.00，按照1∶4的體積比將TPP溶液滴加入殼聚糖溶液中，攪拌1 h形成CS-TPP膠束。將殼聚糖-三聚磷酸鈉(CS-TPP)膠束與牛血清白蛋白以1∶4的濃度比混合，在90℃條件下反應(yīng)1 h，待溶液冷卻后使用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至5.95，再使用磁力攪拌0.5 h，殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束能夠在特定pH值下與高溫變性的牛血清白蛋白交聯(lián)形成粒徑均勻的殼聚糖-三聚磷酸鈉-牛血清白蛋白(CS-TPP-BSA)膠束。

圖1 (a) 殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式;(b)殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束(CS-TPP)的自組裝原理Fig 1 Chemical structural formula for chitosan and self-assembly principle of chitosan-sodium tripolyphosphate micelles (CS-TPP)

圖2 殼聚糖-三聚磷酸鈉-牛血清白蛋白膠束(CS-TPP-BSA)的制備原理圖Fig 2 Schematic diagram of preparation of chitosan-sodium tripolyphosphate-bovine serum albumin micelle (CS-TPP-BSA)

1.2.2 功能化膠束引入材料表面

將玻璃片用玻璃刀切成1 cm×1 cm大小作為基底材料，用乙醇和RO水分別超聲清洗3遍，每次5 min，吹干備用。將切好且清洗好的玻璃片置于大的玻璃培養(yǎng)皿中，加入多巴胺-鹽酸鹽(2 mg/mL)的Tris緩沖液(pH=8.50)使之沒過基底材料表面，于37 ℃下反應(yīng)過夜，將反應(yīng)后的多巴胺溶液倒出，用RO水超聲清洗，每次5 min以除去材料表面弱結(jié)合的多巴胺，將沉積了多巴胺涂層的玻璃片浸沒在CS-TPP和CS-TPP-BSA溶液中12h，用RO水清洗干凈后烘干待用。

圖3 功能化膠束在聚多巴胺表面固定示意圖Fig 3 The functionalized micelles grafted on the surface of polydopamine

1.2.3 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的水合粒徑及Zeta電位

取等量制備好的CS-TPP和CS-TPP-BSA溶液，在馬爾文激光粒度儀中對兩組樣品的水合粒徑和Zeta電位進行檢測。

1.2.4 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的掃描電鏡圖(SEM)

將接枝到多巴胺涂層玻璃片表面的CS-TPP和CS-TPP-BSA納米顆粒放置于-4 ℃環(huán)境中冷凍2 h，當材料表層液體結(jié)冰之后迅速將其從冰箱中取出，放置于冷凍干燥機中真空干燥，冷凍干燥后使用導(dǎo)電膠粘貼到掃描電鏡專用托盤上噴金處理，置于掃描電鏡真空腔內(nèi)掃描其表面形態(tài)。

1.2.5 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的透射電鏡圖(TEM)

將制備好的濃度為0.1mg/mL的CS-TPP和CS-TPP-BSA膠束滴加到銅網(wǎng)表面，室溫條件下自然晾干，置于透射電鏡的真空腔內(nèi)觀察其結(jié)構(gòu)。

1.2.6 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的激光掃描共聚焦(LSCM)

采用激光掃描共聚焦顯微鏡表征殼聚糖在CS-TPP-BSA膠束中的分布位置，使用熒光素異硫氰酸酯(FITC)標記的殼聚糖進行樣品的制備，將最終產(chǎn)物CS-TPP和CS-TPP-BSA分別進行LSCM表征。

1.2.7 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)

取少量CS-TPP和CS-TPP-BSA膠束溶液進行冷凍干燥，干燥完畢后將二者的粉末分別與溴化鉀在干燥環(huán)境下研磨，壓制成片，之后用傅里葉變換紅外光譜儀進行檢測。

1.2.8 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的X射線能譜(EDS)分析

將制備好的濃度為0.1mg/mL的CS-TPP和CS-TPP-BSA膠束溶液滴加到銅網(wǎng)表面，室溫條件下自然晾干，置于透射電鏡的真空腔內(nèi)利用其EDS附件對納米膠束進行面分析來確定其成分。

1.2.9 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的水接觸角

將空白玻璃片、接枝CS-TPP涂層玻璃片和接枝CS-TPP-BSA涂層的玻璃片進行水接觸角測量。

1.2.10 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束對血小板粘附的影響

將接枝到多巴胺涂層玻璃片表面的CS-TPP和CS-TPP-BSA樣品置于24孔板中。取抗凝兔血于1350rpm離心15 min，取上清液即為富血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)，每孔加入500 μL富板漿浸沒樣品表面，于37 ℃孵育45 min后PBS清洗3次，用2.5%戊二醛固定過夜，將固定好的樣品用PBS清洗3次，用羅丹明溶液避光染色15 min再用PBS避光清洗3次，依次浸泡在50%、75%、90%、100%的無水乙醇中脫水，每次15 min，用熒光顯微鏡觀察其數(shù)量。

1.2.11 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的溶血實驗

用生理鹽水將新鮮人全血稀釋至2%的濃度，陽性對照組使用RO水進行稀釋，陰性對照組使用生理鹽水進行稀釋；將制備好的樣品置于24孔板中，每孔加入500 μL稀釋后的人全血，置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，分別吸取孵育后的樣品浸沒液加入TCP管中，以1 000 r/min的速度離心10 min，吸取上清液置于96孔板中，用酶標儀在540 nm波長下測定吸光度值，并且計算其溶血率。

溶血率=[(A-B)]/[(C-B)]×100%

(1)

式中：A為實驗組的吸光度值；B為陰性對照組的吸光度值；C為陽性對照組的吸光度值。

判斷標準：當溶血率低于5%時，說明材料符合植入材料的標準要求；當溶血率高于5%，說明材料有溶血性，不符合植入材料的標準要求。

1.2.12 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束對血栓吸附的影響

將制備好的樣品置于24孔板中，每孔加入400 μL抗凝兔血，于37℃孵育45min后，用PBS清洗樣品，用2.5%戊二醛固定，觀察材料的抗血栓吸附性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的水合粒徑及Zeta電位

由圖4A的粒徑圖可以得知CS-TPP的粒徑為334.1 nm，CS-TPP-BSA的粒徑為410.1 nm，在牛血清白蛋白結(jié)合前后粒徑發(fā)生了變化，可能是因為牛血清白蛋白的引入增大了膠束的粒徑。對CS-TPP-BSA的穩(wěn)定性進行了檢測，通過測試1 h到42 h的粒徑變化可以看出膠束發(fā)生一定程度的聚集，在6h之后膠束的粒徑不再發(fā)生較大的改變，說明膠束具有較好的穩(wěn)定性。通過Zeta電位分析可以看出CS-TPP的Zeta電位為9.74 mV，CS-TPP-BSA的Zeta電位為12.8 mV，在牛血清白蛋白接枝后納米膠束的電荷數(shù)升高。Zeta電位的絕對值越高體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集，反之，Zeta電位的絕對值越低，此時吸引力大于排斥力，體系分散被破壞因此易于發(fā)生凝結(jié)或凝聚，因此可以說明牛血清白蛋白的引入增強了膠束的穩(wěn)定性。

2.2 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的掃描電鏡圖

由圖4B中的掃描電鏡圖(b1)、(b2)可以看出CS-TPP的粒徑為三百多納米，由(b3)、(b4)可以看出CS-TPP-BSA的粒徑大概為400nm左右，符合DLS的測試結(jié)果。在CS-TPP的掃描電鏡(b1)、(b2)中，因為制備的CS-TPP溶液沒有接枝在多巴胺表面直接涂覆于材料表面，溶液中除了CS-TPP膠束外還存在大量未形成膠束的殼聚糖溶液，所以掃描電鏡下觀察到的膠束被殼聚糖溶液覆蓋導(dǎo)致SEM圖像沒有顆粒分明。圖4B(b3)、(b4)中CS-TPP-BSA通過多巴胺接枝在材料表面，可以觀察到CS-TPP-BSA為大小均一的圓球形顆粒，形態(tài)穩(wěn)定，且均勻分散于材料表面。

2.3 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的透射電鏡圖

在圖4C(c1)、(c2)的TEM圖像中可以觀察到CS-TPP膠束在溶液中不穩(wěn)定，容易形成一些相互連接的團聚體，一些沒有發(fā)生團聚的CS-TPP可以看出CS-TPP膠束的結(jié)構(gòu)為三百多納米的球形結(jié)構(gòu)。在圖4C(c3)、(c4)的TEM圖像中可以觀察到CS-TPP-BSA膠束在溶液中可以穩(wěn)定存在，且大小、形態(tài)均一，不易發(fā)生團聚，分散性較好。通過對單個CS-TPP-BSA膠束進行觀察，可以發(fā)現(xiàn)在膠束表面有一層顏色較淺的包覆層，與CS-TPP膠束相比，其粒徑增大，說明白蛋白在CS-TPP表面成功包覆后，粒徑增大。

圖4 A. CS-TPP和CS-TPP-BSA的水合粒徑及Zeta電位；B. CS-TPP和CS-TPP-BSA的掃描電鏡圖;C. CS-TPP和CS-TPP-BSA的透射電鏡圖Fig 4 The particle size and Zeta potential of CS-TPP and CS-TPP-BSA, and scanning electron microscopy and transmission electron microscopy of CS-TPP and CS-TP-BSA

2.4 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的激光掃描共聚焦(LSCM)熒光圖

由圖5(A)可以看到CS-TPP和CS-TPP-BSA的激光掃描共聚焦熒光圖，因為CS-TPP未接枝在多巴胺涂層表面，且CS-TPP本身不穩(wěn)定容易發(fā)生團聚，從而出現(xiàn)大片黏連的情況，因此經(jīng)過FITC標記的殼聚糖顯示出大片熒光，而CS-TPP-BSA的熒光明顯減少，可能是由于白蛋白包覆在CS-TPP表面導(dǎo)致經(jīng)FITC標記的殼聚糖被白蛋白包裹無法顯示熒光，間接證明了白蛋白接枝在CS-TPP膠束表面。

2.5 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的X射線能譜(EDS)分析

從圖5(B)中CS-TPP和CS-TPP-BSA的EDS面掃描結(jié)果中可以很直觀的觀察到膠束表面的元素變化，因為殼聚糖和三聚磷酸鈉中均無硫元素存在，因此在CS-TPP的EDS元素分布圖中沒有S元素分布，C、N、O元素的熒光分布較弱，推測可能是由于殼聚糖在三聚磷酸鈉的交聯(lián)作用下形成膠束導(dǎo)致基團被自組裝在膠束內(nèi)部，因此表面元素熒光分布較少。引入BSA后，由于BSA中二硫鍵和巰基中硫元素的存在，因此在CS-TPP-BSA膠束表面檢測出S元素分布，同時觀察到C、N、O元素熒光分布增強，說明BSA的引入增強了其熒光強度，進一步證明BSA包覆于CS-TPP膠束的表面。

圖5 (a) CS-TPP和CS-TPP-BSA的激光掃描共聚焦(LSCM)熒光圖;(b) CS-TPP和CS-TPP-BSA的EDS面掃描結(jié)果圖Fig 5 Laser scanning confocal (LSCM) fluorescence and EDS mapping results of CS-TPP and CS-TPP-BSA

2.6 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)

利用紅外光譜對牛血清白蛋白、殼聚糖、三聚磷酸鈉和CS-TPP-BSA膠束進行了表征，對光譜基線進行校正和歸一化后得到圖6結(jié)果。通過對比光譜發(fā)現(xiàn)，在CS-TPP-BSA的紅外光譜中可以觀察到殼聚糖的特征吸收峰。在殼聚糖的紅外光譜中3 750 cm-1到3 300 cm-1范圍內(nèi)寬而強的峰可歸因于O-H的伸縮振動， N-H 的分子間氫鍵的吸收峰在3 446 cm-1， C=O振動對應(yīng)的酰胺Ⅰ帶吸收峰在1 650 cm-1處，在1 594 cm-1處觀察到從酰胺I和II延伸的N-H。在N-H變形和C-N伸縮振動的共同作用下，會在1 332 cm-1和1 089 cm-1處觀察到酰胺Ⅲ帶和C=O產(chǎn)生的條帶。在TPP的紅外光譜中，主要觀察到P=O、PO2、PO3分別在1 220、1 148和1 080 cm-1處拉伸，以及在900 cm-1處PO鍵隨POP的反對稱拉伸。在CS-TPP-BSA中，P=O、PO2和PO3分別在1 220、1 148和1 080 cm-1處存在，證明了殼聚糖摻入TPP，大約3 400 cm-1處O-H伸縮振動產(chǎn)生的峰值趨于擴大，這是由于氫鍵間約束力增加，酰胺Ⅱ帶N-H峰值由1 594 cm-1位移至1 567 cm-1。在1 420 cm-1處，由于羰基的極化增強導(dǎo)致CH2的角變形峰明顯增強。在750 cm-1以下還觀察到由于絡(luò)合構(gòu)象的限制使得TPP的骨架振動模式減少或消失，從而說明氨基與三聚磷酸鈉分子之間發(fā)生了相互作用。有研究表明，當殼聚糖和牛血清白蛋白之間發(fā)生靜電相互作用或者形成氫鍵時會使其在1 650 cm-1和1 332 cm-1處的C=O和N-H組的峰值與純殼聚糖相比有所減少。通過對制備的CS-TPP-BSA膠束進行紅外光譜普進行對比分析，發(fā)現(xiàn)由于殼聚糖多糖陽離子與牛血清白蛋白聚陰離子間的靜電相互作用導(dǎo)致殼聚糖的O-H、C=O和NH2在CS-TPP-BSA上的特征吸收由高波數(shù)向低波數(shù)發(fā)生偏移，進一步證明了CS-TPP-BSA的成功制備。

圖6 CS-TPP和CS-TPP-BSA的FTIR結(jié)果圖Fig 6 FTIR result of CS-TPP and CS-TPP-BSA

2.7 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束的水接觸角(Water Contact Angle, WCA)

圖7是不同樣品的水接觸角結(jié)果，經(jīng)過觀察可以看出玻璃片表面的水接觸角為63.3°±1.00°，在玻璃片表面沉積多巴胺之后水接觸角變?yōu)?1.4°±0.23°，可能是因為沉積多巴胺增大了玻璃片表面的粗糙度，同時由于親水性基團氨基的引入導(dǎo)致材料的親水性增高，從而水接觸角減小。在多巴胺涂層表面接枝CS-TPP后水接觸角變?yōu)?6.5°±0.90°，因為殼聚糖中氨基的引入使材料表面的親水性進一步提高。在多巴胺涂層表面接枝CS-TPP-BSA后水接觸角變?yōu)?5.6±1.05°，可能是因為白蛋白的引入增加了親水性基團氨基和羧基的含量，但是白蛋白通過羧基與殼聚糖的氨基通過靜電相互作用消耗了一部分的親水性基團，因此材料的親水性幾乎沒有發(fā)生改變。

圖7 CS-TPP和CS-TPP-BSA的WCA結(jié)果圖Fig 7 WCA result of CS-TPP and CS-TPP-BSA

2.8 牛血清白蛋白結(jié)合前后的殼聚糖-三聚磷酸鈉膠束對血液相容性的影響

圖8(a)為血小板在各種樣品表面的靜態(tài)粘附熒光結(jié)果圖，通過熒光染色的結(jié)果可以看出沉積了多巴胺涂層的材料表面粘附的血小板數(shù)量明顯多余光滑的玻璃片表面粘附的血小板數(shù)量，主要原因是多巴胺涂層表面存在大量有利于血小板粘附和激活的反應(yīng)性基團，如酚羥基和醌基等。在接枝了CS-TPP之后，由于殼聚糖良好的凝血性能促進了血小板在CS-TPP涂層表面的粘附，而接枝了CS-TPP-BSA的涂層表面血小板的粘附量顯著降低。圖8(b)顯示的是樣品材料對于血栓的吸附情況，由數(shù)碼拍照圖可以很直觀的觀察到空白玻璃片表面對于血栓具有較強的吸附性，在接枝了CS-TPP涂層之后，材料對于血栓的吸附性顯著降低，而接枝CS-TPP-BSA的材料表面具有更加優(yōu)越的抗血栓吸附性能。圖8(c)為溶血實驗結(jié)果的數(shù)碼拍照圖，通過觀察發(fā)現(xiàn)除了陽性對照組發(fā)生了溶血現(xiàn)象，其他組均未出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象。根據(jù)圖8(d)的溶血率統(tǒng)計圖可以看出陰性對照組的溶血率為0，陽性對照組的溶血率為100，CS-TPP和CS-TPP-BSA的溶血率均低于5%，且CS-TPP-BSA的溶血率低于CS-TPP的溶血率，說明材料均不具有溶血性。綜上所述， CS-TPP-BSA膠束能顯著改善生物材料表面的抗血小板及血栓吸附性能，具有良好的血液相容性，符合生物材料的植入標準要求。

圖8 (a) CS-TPP和CS-TPP-BSA對血小板的粘附熒光圖;(b) CS-TPP和CS-TPP-BSA的溶血實驗結(jié)果;(c) CS-TPP和CS-TPP-BSA的血栓吸附實驗結(jié)果Fig 8 Fluorescence of platelet adhesion between CS-TPP and CS-TP-BSA and hemolysis test and thrombus adsorption experiments results of CS-TPP and CS-TPP-BSA

3 結(jié) 論

(1)本研究將殼聚糖在交聯(lián)劑三聚磷酸鈉的作用下在水溶液中自組裝形成CS-TPP膠束，由于殼聚糖帶正電荷，牛血清白蛋白帶負電荷，二者在通過靜電相互作用力結(jié)合形成410 nm左右大小均一、形態(tài)穩(wěn)定且分散性良好的CS-TPP-BSA膠束。

(2)通過多巴胺將CS-TPP-BSA膠束接枝在血液接觸材料表面形成膠束涂層，經(jīng)過CS-TPP-BSA改性后的材料表面親水性提高，且在與血液接觸時能夠抗血小板粘附以及抗血栓粘附，不會發(fā)生溶血現(xiàn)象，具有良好的血液相容性。