基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“葶藶子-紫菀”抗肺癌的作用機(jī)制

李明珠， 楊柱， 吳群， 孫冬雪， 陳果， 唐東昕

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要病因，其發(fā)病率和死亡率均位于我國惡性腫瘤中首位[1]。目前肺癌的治療以手術(shù)、放化療、靶向及免疫治療為主，中醫(yī)藥輔助抗癌因其獨(dú)特的優(yōu)勢占據(jù)越來越重要的地位，在減輕肺癌患者術(shù)后、放化療后毒副作用，抑制腫瘤增大，改善患者生存質(zhì)量方面作用尤為明顯。

本研究基于劉尚義教授臨證診治肺癌用藥規(guī)律探討“葶藶子-紫菀”抗肺癌機(jī)制，劉尚義教授是第二屆“國醫(yī)大師”，擅長運(yùn)用中醫(yī)藥防治腫瘤疾病，認(rèn)為“痰”“瘀”“毒”是促使肺癌發(fā)生的主要病理產(chǎn)物，同時通過數(shù)據(jù)挖掘分析發(fā)現(xiàn)，劉尚義教授臨床診治肺癌常以軟堅(jiān)散結(jié)，活血消癥類中草藥為基礎(chǔ)，靈活配伍清熱解毒類、養(yǎng)陰類、燥濕化痰類、止咳定喘類藥物[2]。其中常用的“葶藶子-紫菀”藥對便是在炙鱉甲、莪術(shù)散結(jié)消癥的基礎(chǔ)上達(dá)到泄肺濁，宣肺氣，祛痰瘀的目的。

葶藶子為十字花科植物獨(dú)行菜（北葶藶子）或播娘蒿（南葶藶子）的干燥成熟種子，性寒、味苦辛，沉降下行，歸肺與膀胱二經(jīng)[3]，具有瀉肺平端，行水消腫之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，其主要含有黃酮類、芥子苷類、苯丙素類、有機(jī)酸類等成分[4]，具有止咳平喘、改善心血管、強(qiáng)心、利尿、抗腫瘤等作用[5，6]。桂家輝[7]研究表明南葶藶子的乙酸乙酯浸膏能顯著誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有成為抗肺癌藥物的潛力。紫菀為菊科植物紫菀的根和根莖，味辛、甘、苦，性微溫，歸肺經(jīng)，功能潤肺下氣，消痰止咳[8]。主要含有萜類、黃酮類、肽類、蒽醌類、香豆素類、甾醇類及有機(jī)酸類等成分，具有祛痰、止咳平喘、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等多種作用[9，10]，臨床廣泛用于肺系疾病。邵世祥[11]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)使用復(fù)方紫菀飲可提高肺癌患者化療近期療效，減輕化療毒副反應(yīng)，但其抗肺癌作用靶點(diǎn)及機(jī)制作用尚不明確。因此本文通過結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理方法，對“葶藶子-紫菀”活性成分的抗肺癌作用進(jìn)行研究，希望了解其中機(jī)制，為臨床治療起到指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1 “葶藶子-紫菀”化學(xué)成分及成分靶點(diǎn)的收集和篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫分別檢索葶藶子、紫菀2 味藥的化學(xué)成分和靶點(diǎn)，參考藥代動力學(xué)參數(shù)（ADME），以口服生物利用度（bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選。其中OB是指口服藥物的活性基或有效成分到達(dá)體循環(huán)并被吸收的程度和速度，是評價活性成分藥動學(xué)行為的關(guān)鍵指標(biāo)；DL 是藥動學(xué)特性和安全性的總和，是評價成藥性優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)[12]。

1.2 肺癌靶點(diǎn)篩選

分別檢索GeneCards 及OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取與肺癌相關(guān)靶基因，合并兩個數(shù)據(jù)庫所獲得的數(shù)據(jù)，刪除重復(fù)項(xiàng)后將獲取藥物靶點(diǎn)和肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行重合，利用Venn 2.1 軟件繪制韋恩圖獲得“葶藶子-紫菀”活性成分具有抗肺癌作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

依據(jù)TCMSP 平臺所篩選出的葶藶子和紫菀活性成分作用靶點(diǎn)，以及肺癌的基因靶點(diǎn)，采用Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到葶藶子和紫菀的主要活性成分靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.4 靶點(diǎn)蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI）構(gòu)建

將“葶藶子-紫菀”與肺癌的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，限制篩選物種為“Homo Sapiens”，選取minimum required interaction score＞0.9 的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），同時設(shè)置隱藏游離點(diǎn)。將所得蛋白互作關(guān)系及核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件繪制網(wǎng)絡(luò)可視圖。

1.5 GO分析與KEGG通路富集分析

將網(wǎng)絡(luò)中的靶蛋白投射到DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO 分析和KEGG 信號通路分析，并繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 “葶藶子-紫菀”活性成分的篩選

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)篩選條件得到葶藶子活性成分12 種，紫菀活性成分19 種（表1），兩者所含相同成分4種。

2.2 “葶藶子-紫菀”活性成分抗肺癌的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

對27 種化學(xué)成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到葶藶子168個靶蛋白，紫菀178個靶蛋白。通過檢索GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫，合并去重后最終獲得22 722 個肺癌相關(guān)靶點(diǎn)基因。將“葶藶子-紫菀”有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，與肺癌對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，繪制韋恩圖（圖1），結(jié)果表明藥物與疾病交集基因共184個，其中屬于葶藶子的有167個，屬于紫菀的有177個，二者共同靶點(diǎn)160 個，即為“葶藶子-紫菀”抗肺癌潛在作用靶點(diǎn)。韋恩圖結(jié)果提示葶藶子、紫菀均具備多個抗肺癌基因，兩藥關(guān)鍵靶點(diǎn)可單獨(dú)發(fā)揮作用，同時又有共同的作用靶點(diǎn)，合用可增強(qiáng)抗肺癌作用。

表1 “葶藶子-紫菀”活性成分Table 1 Active constituents of“Semen lepidii-Tatarian aster”

圖1 肺癌相關(guān)靶點(diǎn)基因與“葶藶子-紫菀”有效成分靶點(diǎn)關(guān)系的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of relationship between lung cancer related target and the effective component target of“Semen lepidii-Tatarian aster”

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建“葶藶子、紫菀-活性成分-蛋白靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行分析。以17種化合物和184 個潛在靶點(diǎn)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。圖2 中三角形（黃色）代表“葶藶子-紫菀”藥對，圓形（棕紅色系）代表藥物活性成分，菱形（藍(lán)色系）代表蛋白靶點(diǎn)。并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)原理篩選自由度（Degree）較大的化合物節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，網(wǎng)絡(luò)圖中Degree 越大則圖中顏色越深，形狀越大，其中重要的抗肺癌成分依次為槲皮素（quercetin）、山萘酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、異鼠李素（isorhamnetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、常春藤皂苷元（hederagenin）、高良姜素（galangin）等。

2.4 “葶藶子-紫菀”與肺癌靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

從韋恩圖得到藥物-疾病交集靶點(diǎn)184 個，將這些潛在靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)過篩選設(shè)置蛋白互作分值為0.96，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，得到蛋白互作關(guān)系網(wǎng)并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，進(jìn)一步構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)可視圖（圖3），通過線條將存在關(guān)系的兩節(jié)點(diǎn)（即蛋白）相連，節(jié)點(diǎn)越大相應(yīng)的度值越大，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大，其中包含184 個節(jié)點(diǎn)，322 條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)3.5，平均類聚數(shù)0.342。其中度值排名前5的蛋白質(zhì)為TP53、JUN、TNF、AKT1、CDKN1A，這些度值較大的蛋白質(zhì)在整個網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用。

圖2 “葶藶子-紫菀”有效成分和肺癌的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Target network of active components of“Semen lepidii-Tatarian aster”and lung cancer

圖3 “葶藶子-紫菀”和肺癌共同靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系圖Figure 3 Protein-Protein Interaction between of common targets of“Semen lepidii-Tatarian aster”and lung cancer

2.5 GO分析及KEGG通路分析

將“葶藶子-紫菀”與肺癌交集的184 個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，物種選擇Homo sapiens（Human），得到GO 分析632 個生物過程，KEGG相關(guān)信號通路132條。

圖4 “葶藶子-紫菀”抗肺癌的生物學(xué)過程分析圖Figure 4 Analysis of the anti-lung cancer biological process of“Semen lepidii-Tatarian aster”

2.5.1 基因生物功能（GO）分析

圖5 “葶藶子-紫菀”抗肺癌的信號通路圖Figure 5 Anti-lung cancer signal pathway of“Semen lepidii-Tatarian aster”

表2 “葶藶子-紫菀”藥對抗肺癌的基因生物功能信息Table 2 Gene biological function information of“Semen lepidii-Tatarian aster”in treatment of lung cancer

在632條生物學(xué)功能分析條目中，根據(jù)校正后P值排序篩選功能排名前20名條目（P ≤0.01），利用AIPuFu 平臺繪制“葶藶子-紫菀”抗肺癌的生物學(xué)過程分析圖（圖4），圖中橫坐標(biāo)代表靶點(diǎn)在該生物學(xué)過程所占得比例，縱坐標(biāo)則為生物過程名稱，點(diǎn)越大表示富集基因越多，點(diǎn)色越深表示P值越小，關(guān)系越密切。根據(jù)GO分析圖結(jié)果顯示富集的生物學(xué)功能主要涉及藥物反應(yīng)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞缺氧反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、雌二醇反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等（表2），表明“葶藶子-紫菀”參與以上生物學(xué)調(diào)控過程發(fā)揮抗肺癌的效果。

2.5.2 KEGG通路富集分析

從David數(shù)據(jù)庫獲取KEGG相關(guān)信號通路132條，根據(jù)校正后P 值排序篩選功能排名前20 名條目（P ≤0.01），利用AIPuFu 平臺繪制“葶藶子-紫菀”抗肺癌的信號通路圖（圖5），圖中橫坐標(biāo)代表靶點(diǎn)在該通路中所占比例，縱坐標(biāo)為富集所得通路名稱。根據(jù)通路圖可知，“葶藶子-紫菀”化學(xué)成分靶點(diǎn)主要富集的通路涉及癌癥通路、非小細(xì)胞肺癌通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路，以及乙型肝炎、恰加斯病（美洲錐蟲?。┖颓傲邢侔?、膀胱癌、胰腺癌等其他腫瘤相關(guān)信號通路（表3）。表明“葶藶子-紫菀”藥對的有效成分靶點(diǎn)可以通過不同通路作用于肺癌，同時拓展治療其他疾病和癌癥的路徑。

表3 “葶藶子-紫菀”藥對抗肺癌的關(guān)鍵通路Table 3 Key pathway of“Semen lepidii-Tatarian aster”in treatment of lung cancer

3 討論

葶藶子、紫菀均可潤肺下氣，化痰止咳，《中華本草》將葶藶子歸為肺、膀胱、大腸經(jīng)[13]，同時紫菀具有通利二便，祛瘀通腑之功?！侗静輩R言》：“治老人血枯氣燥，大便不通。”《素問·太陰陽明論》云：“脾與胃，以膜相連耳”，“肺與大腸相表里”是中醫(yī)重要的臟腑理論，肺與大腸通過經(jīng)脈的絡(luò)屬而構(gòu)成表里關(guān)系，兩者在生理上相互協(xié)調(diào)，病理上相互影響，治療上相互為用。糞便移植和益生菌的補(bǔ)充已被證明能對多種肺部疾病起到積極的療效，腸道菌群也被證明可以提高宿主抗癌免疫反應(yīng)[14]。中醫(yī)學(xué)從表里經(jīng)及藥物功能入手，通過使用歸經(jīng)于大腸的藥物，對肺癌起到了積極的療效[15]。臨床以葶藶子、紫菀為主藥的常用方有葶藶大棗瀉肺湯、葶藶子十五味丸、紫菀飲等，對咳嗽、痰飲病有較好療效。

通過篩選，葶藶子和紫菀發(fā)揮藥效的核心化合物主要為槲皮素、山萘酚、木犀草素、異鼠李素、β-谷甾醇、常春藤皂苷元、高良姜素。槲皮素、山奈酚、異鼠李素及木犀草素均屬于黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于中草藥及果蔬中，并被廣泛應(yīng)用于癌癥的治療中[16]。研究表明槲皮素可通過抑制STAT3 信號通路，進(jìn)而抑制肺癌A549 細(xì)胞的遷移和侵襲能力[17]。山奈酚可通過抑制ERRα發(fā)揮降低非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞侵襲和遷移能力[18]。朱玲等[19]進(jìn)行體內(nèi)外研究結(jié)果表明異鼠李素可下調(diào)bcl-2基因、PCNA蛋白表達(dá)；上調(diào)抑癌基因P53，bax及caspase-3 基因，抑制人體肺腺癌A549 細(xì)胞生長。木犀草素是主要存在于金銀花、菊花、荊芥、白毛夏枯草等傳統(tǒng)中藥中，有研究證實(shí)木在H460移植瘤模型中，木犀草素可通過上調(diào)miR-34a-5p，達(dá)到抑制腫瘤生長，并誘導(dǎo)凋亡的目的[20]。β-谷甾醇是植物甾醇類化合物之一，廣泛存在于蒲葵、爪鉤草等植物藥物中。β-谷甾醇能明顯抑制肺癌A549、NCI-H460細(xì)胞的生長，且呈現(xiàn)劑量依賴性，同時可將A549 細(xì)胞周期進(jìn)展停滯于G2/M期，并引起細(xì)胞凋亡性死亡[21]。常春藤皂苷元為齊墻果酸的衍生物，是一種廣泛存在于藥用植物中的單體化合物。常春藤皂苷元可抑制裸鼠肺癌A549 腫瘤的生長，且受其純度的影響，進(jìn)一步證實(shí)常春藤皂苷元是具有抗肺癌作用的活性成分[22]。高良姜素是中藥高良姜的主要活性成分之一，研究證實(shí)高良姜素可能通過抑制PI3K/AKT 活性，抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖及侵襲能力[23]。結(jié)果顯示兩藥包含相同及不同的化合物，這些化合物均有各自不同的藥理功效，整體配伍使用后可提高其抗肺癌作用。

根據(jù)蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析，本研究中獲得的主要靶點(diǎn)為TP53、JUN、TNF、AKT1、CDKN1A。在這些關(guān)鍵靶點(diǎn)中，TP53 為重要抑癌基因，參與細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期調(diào)控過程，其突變常在肺癌及肺癌高風(fēng)險個體中發(fā)現(xiàn)，86%的小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)TP53 基因突變[24]，甚至因此被視為肺癌療效或預(yù)后的預(yù)測標(biāo)志物。突變型TP53 基因不僅喪失抑癌功能，同時獲得促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及抑制細(xì)胞凋亡等功能[25]。JUN 蛋白是轉(zhuǎn)錄因子AP-1 家族成員，c-Jun蛋白基因可通過參與活化AP-1，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等[26]。當(dāng)原癌基因c-Jun被激活、過度表達(dá)及蛋白磷酸化后，能促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞癌發(fā)生[27]。腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）家族指一組可以引起細(xì)胞死亡或凋亡的細(xì)胞因子，活化的巨噬細(xì)胞是TNF-α 的主要來源，機(jī)體巨噬細(xì)胞在肺癌微環(huán)境中可與TNF-α 相互激發(fā)，TNF-α 高表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)肺癌微血管形成，成為肺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制之一[28]。AKT1 可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，通過參與細(xì)胞凋亡過程影響細(xì)胞的生存[29]。CDKN1A是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可在G1期調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展，近年來研究表明CDKN1A在肺癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[30]。

本文中KEGG 富集通路表明“葶藶子-紫菀”主要通過癌癥通路、非小細(xì)胞肺癌通路，TNF、Toll樣受體等炎癥相關(guān)通路，PI3K/Akt等疾病代謝信號通路，HIF-1信號通路及其他癌癥通路發(fā)揮抗肺癌的作用。PI3K/Akt是經(jīng)典信號通路之一，涉及細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、免疫調(diào)節(jié)等方面[31]，與內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）分化密切相關(guān)，通過抑制PI3K/AKT 通路的活性可降低EPCs在腫瘤微環(huán)境中血管新生能力，進(jìn)而抑制肺癌生長[32]。研究證實(shí)PI3K/Akt 信號通路對p53 的表達(dá)具有關(guān)鍵調(diào)控作用[33]。TNF 信號通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，TNF-α 通過激活TNF 信號通路可促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[34]。研究發(fā)現(xiàn)通過使脂多糖與Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合而激活TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而分別活化c-Jun和c-Fos 的異源二聚體，使肺癌細(xì)胞持續(xù)增殖[35]。研究證實(shí)在肺腺癌中，miR-30a 低表達(dá)可誘導(dǎo)HIF-1α激活，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長[36]。

綜上所述，本研究初步探討“葶藶子-紫菀”藥對的活性成分、核心靶點(diǎn)、關(guān)鍵抗癌機(jī)制及通路，可知“葶藶子-紫菀”能從不同途徑防治肺癌，對肺癌的干預(yù)主要體現(xiàn)在影響肺癌的形成，抗細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖及凋亡等多方面。中藥材既是中醫(yī)治病的藥物資源，也是化學(xué)藥品、國際植物藥、食品工業(yè)等的重要原料。通過系統(tǒng)藥理學(xué)研究“葶藶子-紫菀”抗肺癌的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號通路，將為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供新思路，并有利于充分挖掘藥物的應(yīng)用價值。