王少如 孫偉 周男 趙開 李文健 遲增鵬 王瑩王奇民 童磊 何宗軒 韓紅鈺 陳正崗

1.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島266071；2.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，大連116044；3.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊261021；4.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島266003；5.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院口腔科，濟(jì)南250031；6.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科，青島266005

口腔癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，90%為口腔鱗狀細(xì)胞癌。其中舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）約占口腔鱗狀細(xì)胞癌的30%，是口腔癌中最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，具有發(fā)病率高、發(fā)展快、轉(zhuǎn)移早、致死率高等特點(diǎn)，雖然醫(yī)療技術(shù)在不斷改進(jìn)，但患者5年生存率仍在50%～60%[3]。近年來流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)舌癌發(fā)病率逐漸增加，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[4-5]，故尋找新的治療方案至關(guān)重要。

Rho GTPases 屬于小G 蛋白的Ras 超家族中的一個(gè)獨(dú)立家族，具有三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性，在胞質(zhì)中與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合處于非活性狀態(tài)，與GTP 結(jié)合后處于活性狀態(tài)并與胞膜穩(wěn)定結(jié)合。其作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)可與上游激活物和下游靶點(diǎn)相互作用，通過參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等行為發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。因其羧基末端均含有一個(gè)-CAAX 終端盒，缺乏傳統(tǒng)膜相關(guān)蛋白所具有的跨膜或疏水結(jié)構(gòu)域，需經(jīng)過一系列翻譯后修飾才能發(fā)揮蛋白膜靶向性及生物學(xué)功能[7]。異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase，Icmt）作為Rho 蛋白翻譯后修飾的第三步修飾酶，催化蛋白末端-CAAX 羧甲基化，在增強(qiáng)Rho 蛋白的膜親和力及其生物學(xué)活性中發(fā)揮著重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)Rho 家族成員尤其是RhoA在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如口腔癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]、結(jié)腸癌[12]、胃癌[13]、肝癌[14]等，并與腫瘤的惡性程度、發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后有關(guān)，在舌癌中也已得到證實(shí)[15-17]。近年來通過基因或藥物靶向抑制Icmt，阻斷RhoA 甲基化可對(duì)腫瘤產(chǎn)生一定的影響，但目前有關(guān)Icmt對(duì)TSCC的研究報(bào)道少見。

本研究利用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，通過體外設(shè)計(jì)合成人Icmt 基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）序列，并經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至TSCC 細(xì)胞系CAL-27 和SCC-4，觀察siRNA 對(duì)Icmt 及RhoA 的作用，探討其對(duì)TSCC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為Icmt作為靶點(diǎn)在TSCC治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人TSCC 細(xì)胞系CAL-27 購于中南大學(xué)高等研究中心，SCC-4由山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。高糖型DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（BI 公司，以色列），青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶（Gibco 公司，美國），Icmt-siRNA 合成、轉(zhuǎn)染試劑（廣州銳博生物科技有限公司），RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix Ex TaTM（TaKaRa 公司，日本），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitive realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物Icmt、RhoA、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）合成（上海生工生物工程有限公司），RIPA裂解液、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗人多克隆抗體Icmt、p21、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）（Proteintech公司，美國），RhoA（Abcam 公司，美國），細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phospho-extracellular regulated protein kinases，p-ERK）（CST 公司，美國），細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（MCE 公司，美國），Annexin V-APC/碘化丙啶（propidium staining，PI）熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CAL-27 和SCC-4 培養(yǎng)均采用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青 霉 素 和100 μg·mL-1鏈 霉 素 的DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中分別培養(yǎng)。隔日換液，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時(shí)，以1∶3 的比例接種至新的培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 siRNA 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 分別將處于對(duì)數(shù)生長期的CAL-27 和SCC-4 細(xì)胞以密度為每孔2×105個(gè)接種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照說明書用120 μL riboFECTTMCP Buffer稀釋5 μL 20 μmol·L-1熒光基團(tuán)Cy3 標(biāo)記的siRNA儲(chǔ)存液（轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA 終濃度為50 nmol·L-1），輕吹打混勻以后加入12 μL riboFECTTMCP Reagent，室溫下孵育0～15 min 后，加入到1 863 μL 更新的無雙抗完全培養(yǎng)基中。37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中孵育24 h，于倒置熒光顯微鏡下明確siRNA 的轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 Icmt siRNA 轉(zhuǎn)染沉默Icmt 基因 針對(duì)人Icmt基因序列設(shè)計(jì)并合成3條siRNA（表1）和1條陰性對(duì)照序列NC-siRNA。轉(zhuǎn)染前1 d 以每孔2×105個(gè)分別將CAL-27和SCC-4細(xì)胞接種于不同的6孔板內(nèi)，待貼壁細(xì)胞融合達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組包括空白對(duì)照組（僅加轉(zhuǎn)染試劑）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA）、實(shí)驗(yàn)組（Icmt-siRNA-1組、Icmt-siRNA-2 組、Icmt-siRNA-3 組）。根據(jù)分組，按siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，同上所述制備成不同組別的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA 終濃度為50 nmol·L-1）。棄6 孔 板 內(nèi)原 培 養(yǎng)基，PBS 沖 洗3次，每孔加入適量無雙抗完全培養(yǎng)基，將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入相應(yīng)6 孔板內(nèi)（使終末體積均為2 mL），及時(shí)混勻以后繼續(xù)于孵育箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染一定時(shí)間后進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞水平或分子水平的檢測(cè)。

表1 針對(duì)Icmt基因序列設(shè)計(jì)3條Icmt-siRNATab 1 Three Icmt-siRNA sequences designed for Icmt gene

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)Icmt、RhoA mRNA表達(dá) 按上述分組，提取各組轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞總RNA 并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)每組所提RNA的濃度和純度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取適量RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，每組取2 μL cDNA 進(jìn)行qRT-PCR，均設(shè)3 個(gè)副孔。Icmt 上游引物序列：5’-CGGCATCCTTCTTACGTCGG-3’，下游引物序列：5’-CCACACTGTCAGGGCATAGC-3’；RhoA 上游引物序列：5’-TGTGGCAGATATCGAGGTGGATGG-3’，下游引物序列：5’-GGCCTCAGGCGATCATAATCTTCC-3’；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系的配置及反應(yīng)參數(shù)等均按TB Green Premix Ex TadTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行。使用ABI PRISM 7000 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀對(duì)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)分析后，根據(jù)Ct 值 應(yīng) 用2-△△Ct公 式 量 化 各 組Icmt、RhoA mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，并根據(jù)3 組實(shí)驗(yàn)組Icmt mRNA 的相對(duì)表達(dá)量選取沉默效率最高組作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)研究，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)目的蛋白及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá) 采用RIPA 裂解液提取轉(zhuǎn)染48 h 后各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒提取的各組RhoA 膜蛋白，按照二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒操作說明測(cè)定蛋白濃度并定量蛋白質(zhì)。加1/4 總 體積的Loadingbuffer，100 ℃變 性10 min，等量上樣，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜中，置5%脫脂奶粉中室溫?fù)u床封閉PVDF 膜1 h。加入一抗（Icmt，1∶1 000；RhoA，1∶5 000；p21，1∶800；Cyclin D1，1∶5 000；ERK，1∶1 000；p-ERK，1∶5 000；GAPDH，1∶5 000），4 ℃孵育過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（triethanolamine buffered saline，TBST） 洗膜3 次（每次10 min），置二抗（1∶50 000）孵育夜中，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗膜3 次（每次10 min）。加入電化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光，采集圖像。使用Image J 軟件分析灰度值，并以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算各檢測(cè)蛋白與內(nèi)參的比值。

1.3.5 CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 取對(duì)數(shù)生長期的CAL-27 和SCC-4 細(xì)胞消化離心后，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔（100 μL）2×103個(gè)細(xì)胞，接種于96 孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)30%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染（方法同前），每組均設(shè)5 個(gè)平行副孔。轉(zhuǎn)染后置于孵育箱內(nèi)培養(yǎng)不同時(shí)間（0、24、48、72 h），按試劑盒說明書操作，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長450 nm的光密度（optical density，OD）值，應(yīng)用GraphPad Prism 8.2.1 軟件繪制細(xì)胞增殖曲線，觀察各組細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期變化 轉(zhuǎn)染48 h后，棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，消化收集細(xì)胞懸液1 000 g 離心5 min，1 mL 冰浴預(yù)冷PBS 重懸細(xì)胞，再離心。加入1 mL 冰浴預(yù)冷70%乙醇輕吹打混勻后4 ℃固定過夜，冰浴預(yù)冷PBS 洗滌2 次后，每管樣品加0.5 mL PI 染色，37 ℃避光溫浴30 min后在24 h 之內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果采用ModFit LT軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 Annexin V-APC/PI 熒光雙染法凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，分別取各組上清于對(duì)應(yīng)的離心管中待用，加入適量0.25%胰蛋白酶（不含乙二胺四乙酸）消化收集細(xì)胞于上述對(duì)應(yīng)離心管中，500 g 離心5 min，棄上清，適量PBS 洗滌1 次后重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每組均取5×105個(gè)重懸細(xì)胞，500 g 離心5 min，PBS 洗滌1 次，加入500 μL 稀釋的1×Annexin V BindingBuffer 工作液重懸細(xì)胞。依次加入5 μL Annexin V-APC和5 μL PI 染色液，渦旋混勻，室溫避光孵育20 min 后立即上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果采用FlowJo V10 軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.2.1 軟件進(jìn)行作圖統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染效率

熒光組CAL-27 和SCC-4 細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染熒光基團(tuán)Cy3標(biāo)記的siRNA 24 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，對(duì)比相同視野在普通光鏡下和熒光顯微鏡下均發(fā)現(xiàn)90%以上的細(xì)胞都顯示紅色熒光（圖1），表明多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染效率高。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Icmt、RhoA mRNA的表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 24 h 后，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組Icmt mRNA 表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），各實(shí)驗(yàn)組Icmt mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05），而RhoA mRNA 表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）（圖2）。對(duì)各實(shí)驗(yàn)組Icmt mRNA的表達(dá)進(jìn)行比較，Icmt-siRNA-1和Icmt-siRNA-3 組的沉默效率最高，故后續(xù)應(yīng)用這2 組作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行研究。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)

Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h 后各組細(xì)胞蛋白表達(dá)量，結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Icmt 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），RhoA總蛋白表達(dá)無明顯區(qū)別（P＞0.05），而RhoA 膜蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖3）。

2.4 轉(zhuǎn)染后對(duì)各組細(xì)胞增殖能力的影響

在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h 后，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞增殖能力無明顯差異（P＞0.05），而實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間變化細(xì)胞增殖能力逐漸下降（P＜0.05）（圖4）。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染效率Fig 1 siRNA transfection efficiency

圖2 轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA后各組細(xì)胞Icmt、RhoA mRNA的表達(dá)Fig 2 Expression of Icmt and RhoA mRNA after Icmt-siRNA transfection

2.5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的周期變化

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h 后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組相比，G1 期細(xì)胞比例增加，S 期細(xì)胞比例減少，G2 期細(xì)胞比例無明顯變化，細(xì)胞周期阻滯在G1/S 期，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示Cyclin D1 蛋白表達(dá)下降，p21 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）（圖6）。

2.6 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡能力的變化

在各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，利用Annexin VAPC/PI 熒光雙染法于流式細(xì)胞儀檢測(cè)得出各象限細(xì)胞比率，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Icmt-siRNA-1 組、Icmt-siRNA-3 組CAL-27 細(xì)胞凋亡率分別為（3.80±0.09）%、（6.01±0.20）%、（15.30±0.45）%、（12.53±0.28）%；SCC-4 細(xì)胞凋亡率分別為（1.66±0.12）%、（2.30±0.03）%、（8.60±0.05）%、（6.80±0.11）%。結(jié)果均發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞增加（P＜0.05）（圖7）。

2.7 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞ERK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白ERK和p-ERK的表達(dá)變化

為研究體外沉默Icmt 對(duì)CAL-27 及SCC-4 細(xì)胞影響的相關(guān)機(jī)制，采用Western blot 檢驗(yàn)ERK 信號(hào)通路的相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，ERK 蛋白表達(dá)無變化，p-ERK蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）（圖8）。

圖3 轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA后各組細(xì)胞Icmt和RhoA蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of Icmt and RhoA protein after Icmt-siRNA transfection

圖4 轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA后對(duì)各組細(xì)胞增殖能力的影響Fig 4 Effection of Icmt-siRNA transfection oncell proliferation capacity

圖5 轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA后各組細(xì)胞周期的變化Fig 5 Cell cycle changes after Icmt-siRNA transfection

圖6 轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和p21的表達(dá)Fig 6 Expression of Cyclin D1 and p21 protein after Icmt-siRNA transfection

圖7 轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA后細(xì)胞凋亡能力的變化Fig 7 Effection of Icmt-siRNA transfection on cell apoptosis

3 討論

Icmt 是相對(duì)分子質(zhì)量為32 000 的蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）上，催化小G 蛋白家族成員的-CAAX 末端殘基的甲基化修飾[8]，其對(duì)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞生長至關(guān)重要，同時(shí)對(duì)許多癌蛋白的穩(wěn)定和功能的發(fā)揮也非常重要[18]，如可促進(jìn)Rho 蛋白的膜親和力及信號(hào)傳遞功能[19]。研究[20-22]表明，Icmt 在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如在卵巢癌的檢測(cè)樣本中發(fā)現(xiàn)Icmt 的表達(dá)較正常組織可高達(dá)93%，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)并不是所有被測(cè)試的樣本中被觀察到上調(diào)。在檢測(cè)的肝癌樣本中也發(fā)現(xiàn)，Icmt 僅在70%的肝癌樣本中表現(xiàn)為高表達(dá)狀態(tài)。這些結(jié)果表明，Icmt 的表達(dá)情況可能存在組織差異性問題，但其在惡性腫瘤中多表現(xiàn)為上調(diào)。并有大量研究[23-26]證明，Icmt 在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的維持、生長增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，降低Icmt 酶活性可能是一種更有效的抗癌靶點(diǎn)，近年來受到了越來越多的關(guān)注，但其對(duì)TSCC的影響尚未明確。

本研究采用siRNA干擾技術(shù)，以CAL-27和SCC-4 細(xì)胞為研究對(duì)象，體外沉默Icmt 基因，觀察對(duì)TSCC的影響。結(jié)果顯示有效沉默Icmt基因表達(dá)后，各組RhoA mRNA 和總蛋白的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組雖無明顯差異，但RhoA 膜蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低。由此推測(cè)，沉默Icmt并不影響RhoA 基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的翻譯，但可能通過降低RhoA 的甲基化修飾，影響胞質(zhì)內(nèi)RhoA 蛋白與細(xì)胞膜的穩(wěn)定結(jié)合。只有被修飾后的RhoA 才能正確的定位于細(xì)胞膜上，以參與細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞黏附和遷移、細(xì)胞凋亡等[6]。Bergo 等[27]將抑制Icmt 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響歸因于抑制Icmt 酶活性影響了RhoA 羧基末端的甲基化修飾，使其與細(xì)胞膜穩(wěn)定結(jié)合的水平降低，進(jìn)而減弱與下游效應(yīng)分子的相互作用。此外，研究[18]發(fā)現(xiàn)，Icmt催化的甲基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性也很重要。Manu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，RhoGEF 只與經(jīng)過翻譯后修飾的RhoA 相互作用，促進(jìn)RhoA 由與GDP 結(jié)合的非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為與GTP 結(jié)合的活性狀態(tài)。由此推測(cè)，抑制Icmt 酶活性可能通過降低RhoA的膜結(jié)合水平和活性的發(fā)揮影響TSCC 的發(fā)展。

圖8 轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA后ERK和p-ERK的表達(dá)Fig 8 Expression of ERK and p-ERK protein after Icmt-siRNA transfection

大量研究[22,27,29]表明，降低Icmt 酶活性可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞生長而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡及影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Icmt-siRNA 后，明顯降低了RhoA 與細(xì)胞膜的結(jié)合水平，細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，增殖能力降低而凋亡水平增加。RhoA 作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)可與上游激活物和下游靶點(diǎn)相互作用。有研究[30-32]證實(shí)，RhoA 可直接刺激Cyclin D1啟動(dòng)子并引起Cyclin D1蛋白的上調(diào)及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）的活性，促進(jìn)G1期的進(jìn)展和DNA 合成；亦可以通過介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinas，MAPK）/ERK 信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和CKIs 的水平。RhoA 處于非活性狀態(tài)時(shí)可增加ERK 磷酸化水平，導(dǎo)致p21 表達(dá)增加，抑制增殖[31,33]。通過體外沉默RhoA基因的表達(dá)，可使Cyclin D1 在G1 期的表達(dá)受到明顯的抑制，而p21、p27 表達(dá)水平顯著增高，致舌癌細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞增殖能力降低[17]。在本實(shí)驗(yàn)體外沉默Icmt 后，檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1 表達(dá)下調(diào)，p21 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)測(cè)得ERK 磷酸化水平下降。由此推測(cè)，沉默Icmt 基因的表達(dá)亦可負(fù)性調(diào)控周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、p-ERK 和上調(diào)p21 蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1 期而不能進(jìn)入S期，最終使細(xì)胞增殖受到明顯的抑制，而細(xì)胞凋亡水平相應(yīng)增高。

綜上所述，利用siRNA干擾技術(shù)可有效抑制人舌鱗癌細(xì)胞Icmt基因的表達(dá)，影響RhoA 蛋白羧基末端甲基化修飾，降低穩(wěn)定的膜靶向定位及其活性的發(fā)揮，并通過調(diào)控Cyclin D1、p21和p-ERK的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1/S 期，進(jìn)而抑制舌鱗癌CAL-27 和SCC-4 細(xì)胞增殖而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究為Icmt作為TSCC的基因治療的新靶點(diǎn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但I(xiàn)cmt 對(duì)Rho 家族蛋白的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。