黃盛 張七援 何愛娥 李洪波 張智星

1.武漢理工大學(xué)馬房山校區(qū)東院醫(yī)院口腔科，武漢430000；2.武漢大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓二科，武漢430000；3.武漢市第五醫(yī)院口腔科，武漢430000；4.武漢大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，武漢430000；5.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，武漢430000

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是全球范圍內(nèi)最廣泛發(fā)生的癌癥之一，約占頭頸部腫瘤的38%和所有口腔惡性腫瘤的90%以上[1]。早期患者的5 年生存率為55%～60%，而晚期患者的5 年生存率降至30%～40%[2]。隨著診療技術(shù)的不斷提高，OSCC的存活率有所提高，但在癌癥治療中仍存在非特異性、非選擇性和毒性的巨大挑戰(zhàn)。在接受手術(shù)、放療和/或化療后，大多數(shù)患者會遭受局部缺陷、畸形、功能障礙、耐藥性以及其他無法忍受的毒性和不良反應(yīng)。OSCC復(fù)發(fā)率高，并且易于轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降[3]。因此，OSCC 需要更好的治療，靶向治療可能會作為治療的輔助手段提供最佳選擇[4]。性別決定區(qū)Y 框蛋白9 （sex determining region Ybox 9，SOX9）是一個(gè)SOX 家族轉(zhuǎn)錄因子的成員，在各種組織的發(fā)育和分化中起關(guān)鍵作用[5]。最近，SOX9 被證明參與了各種類型癌癥的發(fā)生或發(fā)展，包括前列腺癌[6]、乳腺癌[7]和腎細(xì)胞癌[8]、皮膚基底細(xì)胞癌[9]和食管癌[10]。然而，SOX9的表達(dá)對OSCC的作用機(jī)制仍不清楚。因此，本研究探索SOX9對人OSCC 細(xì)胞CAL27 微管形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其作用機(jī)制，以期為OSCC的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶（Invitrogen公司，美國）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（PIERCE 公司，美國）；MatrigelTM底膜基質(zhì)（BD 公司，美國）；波形蛋白（Vimentin）、鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin)、Wnt、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和T 細(xì)胞4（T-cell factor-4，TCF-4）抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（NEB公司，美國）；高速低溫離心機(jī)（Beckman 公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國）；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（TS100）（Nicon 公司，日本）；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP （UVP 公司，美國）；ChemiDoc XRS凝膠/發(fā)光圖像分析儀（Bio-Rad公司，美國）；Olympus DP71 免疫熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。SOX9-shRNA1 和SOX9-shRNA2 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CAL27 細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫提供，在有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中生長。當(dāng)所有細(xì)胞融合至80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶分離傳代，然后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將CAL27 細(xì)胞傳代培養(yǎng)于6 孔板中并分為4 組：對照組、Scramble（shRNA-NC）組、SOX9-shRNA1 組、SOX9-shRNA2 組。培養(yǎng)24 h 后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，Carlsbad，CA）根據(jù)組名分別轉(zhuǎn)染SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2，48 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 使 用TRIzol 試劑提取總RNA，并通過超微量紫外分光光度計(jì)在260和280 nm處測定光密度（optical density，OD）值。按照試劑盒說明書，使用Super RT cDNA 試劑盒合成cDNA。此外，使用Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit 進(jìn) 行 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），分別在95 ℃15 s 和60 ℃60 s 條件下使用ABI 7500 將反應(yīng)激活，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。用于該反應(yīng)的SOX9 和磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）的引物序列如下。SOX9 上游引物序列：5’-CAAGAAGGACCACCCGGATT-3’，下游引物序列：5’-AAGATGGCGTTGGGGGAGAT-3’；GAPDH 上游引物序列：5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’，下游引物序列：5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’。

1.3.3 微管形成實(shí)驗(yàn) 測定體外微管形成以確定中性粒細(xì)胞的促血管生成能力。在37 ℃下，每孔在48 孔培 養(yǎng)板 上預(yù) 涂5 mg·mL-1基 質(zhì) 膠（Matrigel）30 min，以使其硬化。將融合的細(xì)胞以密度為每毫升1.5×105個(gè)在37 ℃的條件下懸浮于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。然后使用Olympus DP71 免疫熒光顯微鏡對毛細(xì)管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行拍照并進(jìn)行測量。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察處于對數(shù)生長期的CAL27 細(xì)胞，并且記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 免疫印跡法 使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞樣品。然后，使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下將膜在封閉緩沖液（5%脫脂奶粉和PBS 中的1%Tween-20）中封閉2 h，然后與適當(dāng)?shù)囊豢梗‥cadherin，1∶1 000；N-cadherin，1∶1 000；Fibronectin，1∶1 000）在封閉緩沖液中于4 ℃孵育過夜。隨后，將膜用含Tween-20 的TBS 洗滌以除去上述殘留的一抗，并與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG二級抗體一起孵育，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影，定影，根據(jù)二抗結(jié)合情況調(diào)節(jié)曝光參數(shù)，Image J 掃描目的條帶的灰度值，以內(nèi)參為基數(shù)，其他條帶灰度值與內(nèi)參灰度值之比為相對蛋白表達(dá)水平。

1.3.6 免疫熒光檢測Vimentin的含量 將CAL27細(xì)胞接種到涂有纖連蛋白的玻璃蓋玻片上。在培養(yǎng)24 h 后，PBS 沖洗細(xì)胞，固定于預(yù)冷甲醇中，0.2% Triton X-100 滲透。固定細(xì)胞在1.5%的正常山羊血清中預(yù)孵育，4 ℃下用一抗Vimentin（1∶100 稀釋）孵育過夜。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體37 ℃孵育2 h 后，DAPI 染核5 min，將蓋玻片用PermaFluor Aqueous 固定在載玻片上。使用Olympus DP71 顯微鏡觀察熒光，計(jì)數(shù)可觀察到熒光信號的陽性細(xì)胞。

1.3.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測Wnt 通路激活細(xì)胞按照前面的分組方法分組培養(yǎng)24 h 后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000 根據(jù)組名分別轉(zhuǎn)染SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2，同時(shí)共轉(zhuǎn)染TCF Reporter Plasmid（TOPFLASH），轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒提供的方法檢測報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾SOX9抑制SOX9的表達(dá)

與對照組比較，SOX9-shRNA1組和SOX9-sh-RNA2組SOX9 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低（F=578.000，P=0.000；F=96.850，P=0.000）（圖1）。

2.2 干擾SOX9抑制微管形成

微管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對照組清晰可見大量緊密排列的微管結(jié)構(gòu)，而SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組細(xì)胞微管樣結(jié)構(gòu)的形成數(shù)量明顯減少，且微管的環(huán)狀結(jié)構(gòu)不完整或不典型（圖2）。與對照組（55.91±6.23）相比較，SOX9-shRNA1組（21.78±4.19）和SOX9-shRNA2組（15.46±3.41）微管結(jié)節(jié)數(shù)目顯著減少（F=91.200，P=0.000）。

2.3 干擾SOX9對上皮間質(zhì)形態(tài)的影響

各組細(xì)胞形態(tài)變化見圖3。由圖3 可見，對照組多為梭形的間質(zhì)樣細(xì)胞，少量橢圓形或圓形的上皮樣細(xì)胞。與對照組相比，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組CAL27 間質(zhì)樣細(xì)胞減少，上皮樣細(xì)胞增多（圖3）。

圖1 OSCC細(xì)胞中SOX9的表達(dá)水平Fig 1 The expression levels of SOX9 in OSCC

圖2 微管結(jié)節(jié)數(shù)目的變化 免疫熒光顯微鏡 ×100Fig 2 Changes in the number of microtubule nodules immunofluorescence microscope ×100

圖3 細(xì)胞形態(tài)的觀察結(jié)果 倒置相差顯微鏡 ×400Fig 3 Observation of cell morphology changes inverted phase contrast microscope ×400

2.4 干擾SOX9抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

由Western blot 條帶可見，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組E-cadherin 蛋白表達(dá)量較對照組升高，N-cadherin 和Fibronectin 蛋白表達(dá)量較對照組降低（圖4）。Western blot 灰度分析結(jié)果見表1。與對照組比較，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（F=181.400，P=0.000）；N-cadherin 和Fibronectin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（N-cadherin：F=101.400，P=0.000；Fibronectin：F=122.300，P=0.000）。

圖4 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin蛋白表達(dá)量Fig 4 The protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，F(xiàn)ibronectin

2.5 干擾SOX9降低OSCC中Vimentin的含量

免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞的Vimentin熒光標(biāo)記主要濃集于核區(qū)，胞質(zhì)區(qū)減少；SOX9-shRNA1 組 和SOX9-shRNA2 組 細(xì) 胞 的Vimentin 熒光標(biāo)記主要濃集于胞質(zhì)區(qū)，核區(qū)減少，沒有明顯顯現(xiàn)（圖5）。與對照組（29.63±3.75）比較，SOX9-shRNA1組（3.09±1.18）和SOX9-shRNA2組（1.82±1.03）Vimentin 陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（F=169.700，P=0.000）。

2.6 干擾SOX9 抑制Wnt、β-catenin、TCF-4 的蛋白表達(dá)

Wnt、β-catenin、TCF-4 的蛋白表達(dá)結(jié)果見表2 和圖6。由Western blot 條帶可見，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組Wnt、β-catenin、TCF-4蛋白表達(dá)量較對照組降低。此外，從熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組TCF 報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性較對照組降低（F=94.830，P=0.000）。免疫印跡灰度分析結(jié)果可見，與對照組比較，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組Wnt、β-catenin、TCF-4 蛋白表達(dá)水平顯著降低（Wnt：F=70.290，P=0.000；β-catenin：F=81.740，P=0.000；TCF-4：F=37.020，P=0.000）。

表1 半定量分析E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平變化Tab 1 Semi-quantitative analysis of E-cadherin，N-cadherin，F(xiàn)ibronectin protein expression levels changes %

圖5 免疫熒光檢測Vimentin的陽性表達(dá)量 免疫熒光染色 ×400Fig 5 Immunofluorescence detect the positive expression of Vimentin immunofluorescence staining ×400

表2 半定量分析Wnt、β-catenin和TCF-4蛋白表達(dá)水平變化Tab 2 Semi-quantitative analysis of Wnt，β-catenin and TCF-4 protein expression levels changes

圖6 Wnt、β-catenin和TCF-4蛋白表達(dá)量Fig 6 The protein expression levels of Wnt，β-catenin and TCF-4

3 討論

OSCC起源于口腔上皮，是頭頸部最常見的惡性腫瘤。盡管OSCC的治療取得了很大進(jìn)展，但它仍然是一種具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后不良的致死性疾病[11]。外科手術(shù)技術(shù)、放射療法和多藥化療是目前OSCC最常見的治療方法。然而，耐藥的存在和發(fā)展在很大程度上限制了化療藥物的臨床應(yīng)用[12]。SOX9 被證明參與各種類型癌癥的發(fā)生和發(fā)展，癌細(xì)胞中SOX9 高表達(dá)與不良的臨床結(jié)果呈正相關(guān)[13]。而目前有研究[14]發(fā)現(xiàn)SOX9 可能在OSCC 的癌變發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究進(jìn)一步探索SOX9對人OSCC細(xì)胞CAL27微管形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其作用機(jī)制，尋找對OSCC新的靶向治療策略。

SOX9 的異常表達(dá)已在一些人類癌癥中被觀察到。SOX9 在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它調(diào)節(jié)一系列的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)SOX9 可以抑制NBAT1的表達(dá)，NBAT1 過表達(dá)能引起毛細(xì)血管形成明顯減少，而SOX9 可通過抑制NBAT1 促進(jìn)毛細(xì)血管形成。與其他研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)干擾SOX9 細(xì)胞微管樣結(jié)構(gòu)的形成數(shù)量明顯減少，表明SOX9可誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞CAL27微管形成。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生在上皮腫瘤的進(jìn)展過程中，以增加癌細(xì)胞的遷移性和侵襲性。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個(gè)特殊特征是上皮標(biāo)記物E-cadherin 的下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)記物如Vimentin、Fibronectin 和Ncadherin 的增加[17]。研究發(fā)現(xiàn)敲除SOX9 可明顯抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移以及Vimentin 和Ncadherin 的表達(dá)，并上調(diào)E-cadherin 的表達(dá)[18]。同樣，Huang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)在SOX9 基因敲除的細(xì)胞中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 和γ-catenin 的表達(dá)在蛋白水平上調(diào)而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin 和Ncadherin 的表達(dá)下調(diào)[19]。與其他研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)干擾SOX9 后E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin 和Fibronectin 蛋白表達(dá)水平降低，OSCC 細(xì)胞中Vimentin陽性細(xì)胞數(shù)減少，表明干擾SOX9能抑制OSCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

在經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)中，Wnt配體與其同源膜受體的結(jié)合導(dǎo)致β-catenin 降解復(fù)合物失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)β-catenin 的穩(wěn)定。一旦積累，β-catenin 就會定位于細(xì)胞核，并與DNA 結(jié)合蛋白的Lef-1/TCF 家族相互作用，從而生成功能性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物[20]。β-catenin與細(xì)胞核中TCF/LEF家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[21]。據(jù)報(bào)道，異常的Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與多種人類癌癥之間存在關(guān)聯(lián)[22]。已經(jīng)顯示出Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)會影響OSCC 細(xì)胞的增殖、分化以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[23]。與其他研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)干擾SOX9 明顯抑制Wnt、β-catenin、TCF-4 的蛋白表達(dá)，同時(shí)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾SOX9可降低TCF報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性，表明Wnt/β-catenin通路的激活明顯受到抑制，上述結(jié)果說明SOX9 影響OSCC 的發(fā)展與Wnt/β-catenin 信號通路激活抑制存在一定的聯(lián)系。

綜上所述，本研究通過干擾SOX9 降低了Vimentin 的含量，抑制微管形成，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記分子的蛋白表達(dá)，并抑制了Wnt/β-catenin 通路的激活，表明SOX9可誘導(dǎo)人OSCC細(xì)胞CAL27微管形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這一作用與Wnt/β-catenin通路激活抑制存在一定的聯(lián)系，有待后續(xù)研究進(jìn)一步探索，為臨床上OSCC 的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。