張應(yīng)龍，杜國輝，馬鳳洲，楊洪高，孫德洋，徐少梅

（1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 濟南 250103；2.山東益遠藥業(yè)有限公司，山東 濟南；3.成都領(lǐng)美康動物藥品有限公司，四川 成都）

目前，動物性食品安全問題已成為畜牧業(yè)發(fā)展的一個主要矛盾，人們愈來愈關(guān)注動物體內(nèi)的藥物殘留問題。鹽酸多西環(huán)素主要藥物成分是多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）又名強力霉素或脫氧土霉素，系由土霉素 6-位上脫氧而制成的半合成而成，主要通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而起到抗菌作用，對敏感菌，比如肺炎球菌、破傷風(fēng)桿菌、棒狀桿菌等革蘭陽性菌，以及大腸桿菌、巴氏桿菌、布魯桿菌，對立克次氏體、支原體、螺旋體等也有一定程度的抑制作用[1]。它作為半合成類抗菌藥，其抗菌活性和組織穿透力都表現(xiàn)強，并具有體內(nèi)分布廣、臨床上使用無明顯腎毒性副作用、半衰期較長、較高的生物利用度等諸多優(yōu)點，因此廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[2]。隨著研究的深入，不少學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素不僅有抑菌作用，而且可能通過抑制炎癥因子、信號通路以及基質(zhì)金屬蛋白酶等機制，在組織再生、修復(fù)，延緩組織退變等方面具有重要作用[3]。但多年來由于四環(huán)素類的廣泛應(yīng)用，臨床常見病原菌對本品耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，包括葡萄球菌等革蘭陽性菌及多數(shù)革蘭陰性桿菌均產(chǎn)生耐藥性。多西環(huán)素與四環(huán)素類抗生素不同品種之間也存在著交叉耐藥。動物試驗表明多西環(huán)素有致畸性，體外試驗表明在一定濃度時有致突變的可能。為此，國家各部門對抗生素的使用限制出臺了各種規(guī)定[4]。多西環(huán)素在蛋雞產(chǎn)蛋期和奶牛泌乳期禁用，家禽肌肉中殘留限量為100 μg/kg。多西環(huán)素在牛、豬、家禽的體內(nèi)代謝方式基本相似，殘留標(biāo)志物為其原型本身。新修訂的獸藥藥典中規(guī)定了多西環(huán)素在牛、羊、豬的休藥期（WDT）暫定為 28 d[5]。總之，雖然多西環(huán)素殘留對人體可能造成傷害，屬于嚴(yán)控藥物，但由于多西環(huán)素在臨床上使用時有許多的優(yōu)點，且對于敏感菌所致的畜禽細(xì)菌性疾病的治療，效果顯著[6]，因此在肉雞和蛋雞養(yǎng)殖中存在著一定的需求，臨床用藥完后其殘留情況的相關(guān)報道較少，對雞蛋中的藥物殘留也很少報道，本文對多西環(huán)素在蛋雞用藥后的肉類殘留及雞蛋中的殘留情況做了相關(guān)的試驗。旨在研究多西環(huán)素殘留在蛋雞肌肉中以及雞蛋中的殘留狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用蛋雞 品種新楊黑，440日齡產(chǎn)蛋雞48只，濟南諾恩食品有限公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有熒光檢測器、5.2 pH計；電子天平：感量為0.0001 g和 0.01 g；高速組織搗碎機；聚丙烯離心管；均質(zhì)器：10 000 r/min；離心機：5 000 r/min；固相萃取柱：Waters Oasis HLB小柱（6 ml，200 mg）或同類型小柱；固相萃取裝置帶負(fù)壓抽濾器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.1.3 試劑 試劑均為分析純，試驗用水符合GB/T 6682中一級水標(biāo)準(zhǔn)。甲醇色譜純、正己烷、檸檬酸、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、咪唑、醋酸鎂、鹽酸HCL、優(yōu)級純冰醋酸。標(biāo)準(zhǔn)品：多西環(huán)素，純度＞99 % 。

1.2 方法

1.2.1 給藥方式和劑量 使用含量為5 % 的鹽酸多西環(huán)素可溶性粉，2組分別加輔料 1和輔料 2按不同濃度使用3 d，停藥2 d，即從第5天開始每天檢測雞肉以及雞蛋中的鹽酸多西環(huán)素殘留含量，連續(xù)測6 d。樣品具體兌水量見表1：

表1 給藥方式和劑量

1.2.2 檢測樣品的取得及制備 48只產(chǎn)蛋雞分成2組，每組3只，從飲水機給藥后第5天開始，每天隨機抽取 6只雞蛋，雞蛋經(jīng)拍打器全部混勻后，取 3份蛋液樣品進行檢測。每天屠宰 3只雞，取其胸脯肉作為樣品，3只為 3個樣品。所有樣品裝入清潔容器細(xì)心管內(nèi)，加封，-18 ℃以下冷凍保存。

1.2.3 樣品處理與檢測 主要參考 GB/T 21317-2007[7]方法進行，將上述雞肉樣品、雞蛋樣品化開后分別稱取一定的量進行前處理，并提取。提取后的上清液進行凈化，凈化所用固相萃取小柱預(yù)先依次用 10 ml甲醇、10 ml蒸餾水、5 ml檸檬酸緩沖液活化，取 25 ml提取液上樣，控制速度在 20滴/min，10 ml蒸餾水洗滌，真空抽干，再用15 ml甲醇洗脫，收集洗脫液于100 ml的蒸發(fā)瓶中。40 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用 1 ml磷酸二氫鉀溶液溶解，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，供測定。

1.2.4 色譜條件和質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：色譜柱：BEH C18（50 mm×21 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進柱量：1 μl；流速：0.3 ml/min；流動相及梯度洗脫條件見表 2。（2）質(zhì)譜條件：電離模式：電噴霧正離子；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氮氣流速：800 L/h；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定性：定量離子對見表3。

表2 流動相及梯度洗脫條件

表3 定性、定量離子對

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋中多西環(huán)素殘留檢測結(jié)果

表4 雞蛋中多西環(huán)素殘留量 （μg/kg）

從表 4可以看出，雞蛋中多西環(huán)素殘留值因藥物添加水平不一樣，添加藥物劑量大的一組第2組其殘留含量一直稍大于第 1組，從消除速度來看，蛋雞對多西環(huán)素的降解速率還是很快的，第1組6 d的消除速率為91.4 %，第2組6 d的消除速率為83.2 % 。

2.2 雞肉中多西環(huán)素殘留檢測結(jié)果

表5 雞肉中多西環(huán)素殘留量 （μg/kg）

從表 5可以看出，雞肉中多西環(huán)素殘留值因藥物添加水平不一樣，添加藥物劑量大的一組第2組其殘留含量一直稍大于第一組，但遠小于相同組別雞蛋中的殘留值。從消除速度來看，蛋雞在肌肉中的降解速率更快，第1組6 d的消除速率達到 100 % ，第 2組 6 d的消除速率為98.4 % 。

2.3 討論

本試驗設(shè)計為輔料不同的含量為 50 % 的多西環(huán)素粉劑在蛋雞體內(nèi)的殘留情況，輔料的不同可能會影響到蛋雞吸收多西環(huán)素的水平，但無太多證據(jù)證明；但從本試驗中可以看到，肌肉中的多西環(huán)素殘留明顯少于雞蛋中，且在肌肉中的代謝速率很快，蛋雞應(yīng)用藥物連續(xù) 3 d后，經(jīng)過第4天的代謝，肌肉中的含量已經(jīng)顯示在國標(biāo)允許的范圍內(nèi)，這與柳海[8]在多西環(huán)素藥物殘留在大黃魚體內(nèi)的消除規(guī)律一文中所述（多西環(huán)素在大黃魚體內(nèi)吸收、分布迅速，消除較快）相一致。而在雞蛋中的代謝以及藥物殘留水平遠高于肌肉，按照推算，在雞蛋中的多西環(huán)素殘留量仍將會持續(xù)數(shù)日才能滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求。這與王長青[9]用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中多西環(huán)素的殘留量結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本文通過對鹽酸多西環(huán)素在蛋雞中的殘留狀況初步研究，結(jié)果表明，多西環(huán)素在蛋雞肌肉中分布迅速，消除較快；在雞蛋中含量要遠高于肌肉中含量，雞蛋中的多西環(huán)素殘留量的消除需要一定的時間。因此，在肉雞或淘汰蛋雞養(yǎng)殖過程中可以使用多西環(huán)素，注意用藥時間即可。