張金花，高明星，劉澤霖，谷長勤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

自噬(autophagy)是維持體內(nèi)平衡的一種高度保守過程[1]，該過程將細(xì)胞質(zhì)的大分子、過量或受損的細(xì)胞器及病原體遞送至溶酶體降解，降解產(chǎn)物被機(jī)體重復(fù)循環(huán)利用[2-4]。自噬是一系列自噬體結(jié)構(gòu)演變的過程，由自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)執(zhí)行精細(xì)的調(diào)控。雷帕霉素(rapamycin, Rapa)是目前研究中常用的自噬誘導(dǎo)劑，其可以通過抑制mTOR(mechanistic target of rapamycin)通路來促進(jìn)自噬的發(fā)生[5-6]。渥漫青霉素(wortmannin, Wort)主要通過抑制PtdIns3K Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase)的活性來阻止自噬體的形成[7-8]。氯喹(chloroquine, CQ)在自噬體形成的下游(晚期)抑制自噬體和溶酶體融合和/或阻止溶酶體內(nèi)自噬“貨物”的降解[9-10]。細(xì)胞自噬已被證實(shí)在衰老、神經(jīng)退行性疾病、心臟病、腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用[11]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)進(jìn)化上保守的過程，對于生物體的發(fā)育、生長和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[12]。細(xì)胞凋亡可被多種細(xì)胞信號激活，包括Ca2+濃度升高，氧化損傷引起的羥自由基等活性氧族(reactive oxygen species，ROS)、毒素、NO和激素刺激等[13-15]。凋亡主要信號通路有線粒體途徑與死亡受體途徑[16]。自噬及凋亡是兩種不同的機(jī)制，盡管兩者都參與決定細(xì)胞命運(yùn)，它們可能在細(xì)胞中相互合作或?qū)筟17]。自噬在細(xì)胞中起著雙重作用，既可以作為生存機(jī)制，也可以作為死亡機(jī)制，而凋亡對細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)是單向的[16]，它能及時(shí)主動(dòng)清除機(jī)體衰老及異常細(xì)胞發(fā)揮清道夫作用[18-19]。

日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染主要經(jīng)皮膚毛細(xì)血管或淋巴管至單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行繁殖。達(dá)到一定程度后即侵入血循環(huán)，造成病毒血癥，并侵入血管內(nèi)膜及各靶器官，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、心、肺、腎等，引起全身性病變[20-21]。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡是維持體內(nèi)平衡的重要機(jī)制，在病毒感染過程中，機(jī)體可能通過凋亡或自噬機(jī)制“犧牲”感染細(xì)胞來保護(hù)其他細(xì)胞。本試驗(yàn)通過自噬調(diào)控藥物處理感染JEV小鼠，分析自噬調(diào)控藥物對小鼠腦部JEV感染引起的細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

乙型腦炎病毒P3株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曹勝波教授饋贈(zèng)，病毒采取乳鼠腦內(nèi)擴(kuò)增，空斑試驗(yàn)測定病毒毒價(jià)。6周齡 BABL/c 雌鼠305只，購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。鼠源JEV E抗體腹水由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曹勝波教授饋贈(zèng)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室純化使用?？笲cl2、Bax、Cas3、Cas8及GAPDH單克隆抗體購自 ABclonal 公司。PCR引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建及臨床觀察

動(dòng)物試驗(yàn)遵循《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中的規(guī)定。將305只BALB/c雌鼠分為8組，分別為DMEM(0.10 mL)對照組(Control)；JEV(105PFU，0.10 mL)感染組(JEV)；JEV(105PFU，0.10 mL)+雷帕霉素(Rapa，5.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(JEV+Rapa)；JEV(105PFU，0.10 mL)+渥漫青霉素(Wort，1.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(JEV+Wort)；JEV(105PFU，0.10 mL)+氯喹(CQ，50.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(JEV+CQ)；雷帕霉素(Rapa，5.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(Rapa)；渥漫青霉素(Wort 1.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(Wort)；氯喹(CQ，50.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(CQ)，其中，Rapa、Wort、CQ于感染病毒前2 h給藥，之后每天給藥，給藥時(shí)間持續(xù)10 d，給毒及給藥的方式均為腹腔注射。小鼠持續(xù)喂養(yǎng)20 d，每天觀察并記錄小鼠臨床癥狀，依據(jù)小鼠感染JEV后臨床癥狀評分等級，對小鼠癥狀進(jìn)行評分[22]。所有試驗(yàn)均按照中國湖北省華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院研究倫理委員會(huì)推薦的方案進(jìn)行。

1.3 腦組織樣品采集

小鼠在給藥及感染病毒后10、20 d進(jìn)行取樣，左側(cè)腦組織凍存，右側(cè)腦大腦皮層芝麻粒大小固定于2.5%戊二醛固定液中，送至谷歌生物公司制備切片染色后TECNA110透射電鏡觀察并拍照，剩余部分固定于4%甲醛固定液中。

1.4 Tunel 染色

小鼠感染病毒后10 d，取右側(cè)腦組織固定于4%甲醛固定液中。常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、凋亡檢測試劑盒和Tunnel法定量檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野。正常細(xì)胞核呈藍(lán)色,陽性凋亡細(xì)胞呈棕黃色,并記錄陽性凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.5 組織免疫熒光試驗(yàn)

小鼠感染病毒后10 d，取右側(cè)腦組織制作石蠟切片。將石蠟切片脫蠟至水后，置于3%H2O2中30 min，以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶后于檸檬酸鹽緩沖液中完成抗原修復(fù)。洗滌后，切片在5%BSA中封閉1 h后，將一抗(鼠源抗JEV-E一抗，1∶100；兔源抗Bad一抗，1∶100，)4 ℃孵育過夜。洗滌后，滴加二抗(FITC Goat Anti-Mouse IgG、Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG)孵育2 h，洗滌后，用DAPI染色，使用抗免疫熒光淬滅劑封片。計(jì)數(shù)方式為每張切片10倍鏡下的3個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)取平均數(shù)，其中，每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)為150～200個(gè)。

1.6 熒光定量qPCR檢測目的基因

小鼠感染病毒后10、20 d，取左側(cè)腦組織凍存。Trizol法提取腦組織總RNA，應(yīng)用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)的引物序列如表1。qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè) 循環(huán)；熔解曲線分析，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。采用2-△△Ct分析法計(jì)算各樣本中目的基因的相對表達(dá)水平。

表1 qPCR引物序列

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)量

小鼠感染JEV后10 d，取左側(cè)腦組織凍存。提取組織總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定，參照BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行。Western blot方法檢測Bcl2、Bax、Cas3、Cas8蛋白表達(dá)量。常規(guī)的SDS-PAGE分離的蛋白，轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。TSBT洗膜后，加入TSBT稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜。TSBT洗膜3次，每次10 min，加入TSBT稀釋的二抗，37 ℃ 孵育40 min。TBST洗膜3次，每次10 min，配制顯色工作液，進(jìn)行免疫印跡顯色，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參檢測腦組織Bcl2、Bax、Cas3、Cas8蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Graph Pad Prism 6軟件，單因素方差分析，對各組小鼠腦組織中炎癥因子的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析并作圖。采用Image J軟件對Western blot結(jié)果中自噬及炎癥相關(guān)蛋白的灰度值進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理組小鼠的臨床癥狀

對小鼠的神經(jīng)癥狀進(jìn)行觀察，JEV+Rapa組小鼠癥狀持續(xù)期較長，為5～20 d，且5～20 d均有小鼠出現(xiàn)明顯的立毛、弓背及運(yùn)動(dòng)功能障礙的表型癥狀。JEV組小鼠癥狀持續(xù)期較短，為5～12 d，且部分小鼠出現(xiàn)立毛、弓背及運(yùn)動(dòng)功能障礙的表型癥狀。JEV+Wort組小鼠僅在7～10 d有個(gè)別小鼠出現(xiàn)輕度的精神沉郁及立毛現(xiàn)象，之后恢復(fù)正常。其他組小鼠在飼養(yǎng)期間無明顯神經(jīng)癥狀出現(xiàn)。對各組小鼠的發(fā)病率及生存率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，JEV+Rapa組小鼠發(fā)病率為65.5%，存活率最低；JEV組小鼠發(fā)病率為32.7%；JEV+Wort組小鼠生存率達(dá)90%；JEV+CQ組小鼠生存率近100%；Control組及藥物對照組小鼠都無患病及死亡情況。

2.2 不同處理組小鼠腦部亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化

利用透射電鏡技術(shù)(TEM)，觀察到小鼠感染病毒后10 d，腦組織中自噬體及腦組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平的病理變化。Control組小鼠腦部線粒體無嚴(yán)重?fù)p傷。JEV組小鼠腦組織出現(xiàn)線粒體變圓、線粒體嵴變短的現(xiàn)象。JEV+Rapa組小鼠腦組織線粒體嚴(yán)重?fù)p傷，線粒體變大、變圓，線粒體嵴變短、變淺甚至消失。JEV+Wort及JEV+CQ組小鼠腦組織線粒體輕微損傷(圖1)。

箭頭.線粒體。比例尺=2 μm

2.3 不同處理組小鼠腦部細(xì)胞凋亡差異

利用Tunel染色方法，觀察小鼠感染病毒后10 d，腦組織中細(xì)胞凋亡陽性信號(圖2A)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與JEV+Wort及JEV+CQ組小鼠相比，JEV+Rapa及JEV組小鼠腦組織較多細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡(圖2B)。

A.小鼠腦組織凋亡細(xì)胞分布(紅色箭頭.棕色陽性信號)；B.小鼠腦部細(xì)胞凋亡差異分析(*.P<0.05；**.P<0.01)

2.4 不同處理組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡與病毒感染關(guān)系分析

Bad是一個(gè)促凋亡現(xiàn)象的標(biāo)志基因，利用組織免疫熒光技術(shù)(IF)，觀察到病毒感染10 d后不同處理組小鼠腦組織中促凋亡因子Bad與JEV-E蛋白共定位情況不同: JEV組小鼠腦組織少量神經(jīng)元發(fā)生Bad與JEV-E的共定位現(xiàn)象；JEV+Rapa組小鼠腦組織大量神經(jīng)元發(fā)生Bad與JEV-E的共定位現(xiàn)象；JEV+Wort組及JEV+CQ組小鼠腦組織少量神經(jīng)元出現(xiàn)Bad紅色陽性信號及JEV-E綠色陽性信號，但不發(fā)生共定位現(xiàn)象(圖3)。

A.小鼠腦組織 Bad及JEV-E蛋白免疫熒光成像(紅色.Bad蛋白；綠色.JEV-E蛋白)；B.小鼠腦組織Bad與JEV-E蛋白共定位的細(xì)胞比例(*.P<0.05; **.P<0.01)

2.5 不同處理組小鼠腦組織凋亡因子mRNA表達(dá)量差異

利用qPCR技術(shù)分別檢測病毒感染后10及20 d 不同處理組小鼠腦組織凋亡因子Bax、Bcl2、Bcl-xl的mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果顯示：不同處理組小鼠在病毒感染高峰期10 d時(shí)腦組織中Bax的表達(dá)量未發(fā)生明顯差異，而JEV+Wort組及JEV+CQ組Bcl2及Bcl-xl表達(dá)量略高于JEV組及JEV+Rapa組小鼠(P<0.05)，正常組(Control組)及單獨(dú)給藥組(Rapa組、Wort組、CQ組)小鼠腦組織無明顯變化。病毒感染后20 d，不同處理組小鼠腦組織凋亡因子表達(dá)量恢復(fù)至正常水平(圖4)。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；n=3

2.6 不同處理組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量差異

于JEV感染后10 d收集小鼠腦組織，提取組織蛋白，應(yīng)用Western blot技術(shù)評估細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示：不同處理組小鼠腦部Bcl-2蛋白表達(dá)量變化未發(fā)生明顯差異；與JEV+CQ組小鼠比較，JEV+Rapa及JEV組小鼠腦部Bax蛋白表達(dá)量較高(P<0.05)；與JEV及JEV+CQ組小鼠比較，JEV+Rapa組小鼠腦部Cas3表達(dá)量較高(P<0.05)(圖5)。

A.Western blot結(jié)果；B.Bcl-2/GAPDH；C.Bax/GAPDH；D.Cas3/GAPDH；E.Cas8/GAPDH；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；n=3

3 討 論

JEV是一種人畜共患病原體，對人類健康造成重大威脅，尤其是兒童。因此，建立與人類感染后相似的臨床癥狀及病理特征的研究模型至關(guān)重要，小鼠作為常用于研究JEV的動(dòng)物模型，是較簡單且有效的研究模型。病毒的接種方式具有多樣性，依據(jù)本試驗(yàn)的研究目的，腹腔注射可以模仿JEV感染嚙齒動(dòng)物后通過外周血管及淋巴組織向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳輸病毒的自然感染過程，是JEV接種感染小鼠的優(yōu)選途徑。

JEV感染小鼠后，小鼠會(huì)出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、運(yùn)動(dòng)障礙等明顯的神經(jīng)癥狀[22]。本次動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)顯示，自噬誘導(dǎo)劑Rapa調(diào)控的感染JEV的小鼠在感染后5～20 d均出現(xiàn)不同嚴(yán)重程度的臨床表現(xiàn)，包括精神沉郁、立毛、弓背及感染高峰期出現(xiàn)的眼球充血、后肢癱瘓及轉(zhuǎn)圈的癥狀。僅感染JEV的小鼠在病毒感染后5～10 d出現(xiàn)立毛、弓背、眼球充血及后肢癱瘓的臨床癥狀，后期恢復(fù)至正常。自噬早期抑制劑Wort調(diào)控的感染JEV小鼠部分出現(xiàn)精神沉郁、立毛、弓背的早期輕度癥狀。自噬晚期抑制劑CQ調(diào)控的感染JEV小鼠未出現(xiàn)明顯表型癥狀。正常組及藥物對照組小鼠未出現(xiàn)異常表現(xiàn)。JEV感染小鼠的臨床癥狀與之前相關(guān)研究[23-24]的結(jié)果一致。

JEV感染小鼠腦組織能引起神經(jīng)元細(xì)胞的壞死，其中一種機(jī)制就是引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[25]。Bad是促細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白，能正反饋調(diào)控細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[26]。本研究對不同處理組小鼠腦組織中凋亡蛋白Bad與JEV-E蛋白的共定位情況檢測分析發(fā)現(xiàn)JEV及JEV+Rapa組小鼠腦組織較多神經(jīng)元發(fā)生Bad與JEV-E的共定位，JEV+Wort及JEV+CQ組小鼠腦組織神經(jīng)元未發(fā)生明顯共定位現(xiàn)象。另外，本研究對不同處理組小鼠腦部凋亡因子的表達(dá)量檢測分析發(fā)現(xiàn)JEV及JEV+Rapa組小鼠腦部促凋亡因子表達(dá)量呈上調(diào)趨勢。因此，結(jié)合之前的試驗(yàn)結(jié)果，分析自噬抑制劑Wort及CQ減弱JEV感染引起的神經(jīng)元凋亡程度，對感染JEV小鼠具有一定的保護(hù)作用。

Caspase家族是促細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，通過級聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)細(xì)胞凋亡[27-28]。Caspase8通過與死亡配體相似的caspase途徑和線粒體依賴途徑激活caspase3或作用于其他Caspase成員和凋亡相關(guān)死亡受體信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29-30]。Bcl-2家族蛋白主要控制線粒體凋亡途徑，由抗凋亡和促凋亡分子組成。Bcl-2家族蛋白主要分為3類：第1類是抗凋亡蛋白，如Bcl-xl；第2類是促凋亡蛋白，如Bax和Bak；第3類是只有BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白[31]。本研究對不同處理組小鼠腦部相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)量檢測分析發(fā)現(xiàn)自噬調(diào)控藥物對感染JEV小鼠腦部凋亡蛋白的表達(dá)量無明顯影響。結(jié)合本課題組研究[32]建立動(dòng)物模型數(shù)據(jù)，分析本研究中病毒感染量較低，不足以引起明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。另外，細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的相互作用較復(fù)雜，既相互協(xié)同又相互拮抗，細(xì)胞凋亡通路的激活或抑制也可能受自噬調(diào)控藥物調(diào)控的自噬過程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，JEV感染神經(jīng)細(xì)胞系，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過P38依賴的，CHOP蛋白介導(dǎo)的通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33-35], 而且JNK分子在JEV感染引起的細(xì)胞凋亡中起到作用[35-36]。JEV感染引起細(xì)胞凋亡的通路復(fù)雜多樣，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)建立自噬調(diào)控藥物處理的JEV小鼠模型，通過觀察感染JEV小鼠的臨床癥狀及腦部線粒體結(jié)構(gòu)損傷程度，檢測分析小鼠腦部相關(guān)凋亡因子mRNA及蛋白的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑渥漫青霉素及氯喹對日本腦炎病毒感染引起的細(xì)胞凋亡具有一定的減弱作用，但具體機(jī)制需從多個(gè)方面深入研究。

4 結(jié) 論

建立自噬誘導(dǎo)劑及自噬抑制劑處理的乙型腦炎病毒感染小鼠的動(dòng)物模型，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑渥漫青霉素和氯喹可通過降低Caspase活性，抑制Caspase通路級聯(lián)反應(yīng)，減弱乙型腦炎病毒感染小鼠后引起的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。