李艷紅，劉 潔，吳正理

(西南大學水產學院 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715)

肥大細胞(mast cell, MC)是一種起源于骨髓或者其他造血組織的多功能造血干細胞，在組織中分化成熟、并能在組織中長期存活的一類炎癥效應顆粒細胞。成熟的肥大細胞表達2種主要的表面受體：高親和力的IgE受體(high affinity IgE receptor, FcεRI)和干細胞因子(stem cell factor, SCF)受體c-Kit(CD117)[1-2]。肥大細胞作為一類重要的免疫效應細胞，分布于各種組織、器官的表皮或黏膜上，在IgE介導的過敏性疾病中發(fā)揮核心作用[1]。通過膜上組成型表達的FcεRI結合并交聯(lián)抗原依賴性的IgE，可致敏、活化肥大細胞，繼而觸發(fā)胞內信號級聯(lián)反應，促進各種炎性介質的釋放，包括其細胞質顆粒內的多種生物活性物質(如組胺)，以及從頭合成的細胞因子和趨化因子[3-4]。過敏疾病是肥大細胞炎癥介質的過度產生和釋放的一種表現(xiàn)[5]，在人[6-8]和養(yǎng)殖動物[9-10]中發(fā)生的概率越來越大，而且養(yǎng)殖寵物和人之間可以相互影響產生過敏反應[9, 11]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，食物源過敏事件[12-15]、疫苗過敏事件[16-17]頻發(fā)，給養(yǎng)殖生產帶來較大的經濟損失。為此，深入了解動物過敏的分子機制，有利于預防和治療動物過敏性疾病，為畜牧業(yè)的健康生產提供理論依據(jù)。

鈣調磷酸酶(calcineurin, CaN)是一種參與多種細胞功能調節(jié)的多功能信號酶，由催化亞基(CnA)和調節(jié)亞基(CnB)組成的異源二聚體，在許多生物學過程以及疾病的發(fā)生中起關鍵作用，如在cAMP代謝、微管組裝、骨骼肌代謝、血管平滑肌細胞、T細胞的活性(活化、分化及增殖)等過程中起至關重要的作用[18]；在心肥大、骨質疏松、骨骼肌纖維化、變態(tài)反應和自身免疫性疾病[19-20]及神經元生長和突觸可塑性[21]等多種疾病的免疫應答中扮演中心角色。CaN-NFAT信號通路可通過活化T細胞而參與哮喘的整個發(fā)病過程[22-23]，同時，參與了控制免疫、神經、心血管、骨骼系統(tǒng)發(fā)育和功能的信號級聯(lián)放大調節(jié)[20]；鈣調磷酸酶還可以通過激活NFκB信號途徑刺激天然免疫反應[24]；且受鈣調磷酸酶調節(jié)的轉錄因子NFAT[25]和NFκB[26]均參與肥大細胞的脫顆粒過程，但鈣調磷酸酶是否參與肥大細胞顆粒的形成以及脫顆粒過程，仍未見報道。本研究旨在探究鈣調磷酸酶對肥大細胞脫顆粒的影響，以期為動物過敏性疾病的預防提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

胎牛血清、培養(yǎng)基(DMEM/F12、Opti-MEM)、磷酸緩沖液(PBS)、雙抗、胰酶均購自美國Gibco公司。限制性內切酶、嘌呤霉素、TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、BpiⅠ內切酶、Lipofectamine 3000、DNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Trizol試劑購自Invitrogen公司。A23187、Carnoy固定液、HBSS緩沖液、LPS、anti-DNP IgE、DNP-BSA、甲苯胺藍、C48/80、p-NAG、NP-40、WST-1購自Sigma公司。pX459質粒為廣西大學林文珍教授饋贈。

1.2 細胞培養(yǎng)

大鼠肥大細胞系(RBL-2H3，中國科學院昆明動物研究所)培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，貼壁生長，當細胞覆蓋率達80%以上時以1∶3傳代，在細胞對數(shù)生長期進行試驗。

1.3 pX459-CnAβ-sgRNA載體構建與檢測

使用在線軟件CRISPR direct在大鼠CnAβ基因序列(NC_005114.4)的第一個外顯子上設計3個sgRNA寡核苷酸序列。根據(jù)質粒pX459中BpiⅠ酶切位點的結構，在sgRNA正義鏈寡核苷酸序列的5′端添加“CACC”，并在反義鏈寡核苷酸序列的5′端添加“AAAC”。為提高轉錄效率，若sgRNA正義鏈寡核苷酸序列的“CACC”后面的堿基不是“G”，則需要添加堿基“G”或“GG”，并在反義鏈寡核苷酸序列的3′端添加堿基“C”或“CC”，同時，設計無義DNA序列作為對照(control oligo)，序列設計結果見表1。將合成的兩條單鏈sgRNA退火形成雙鏈sgRNA，然后，經BpiⅠ酶切再與經BpiⅠ酶切的pX459載體連接，轉化入大腸桿菌DH5α，最后，進行陽性質粒篩選和測序驗證。

表1 CnAβ基因的sgRNA序列

1.4 CnAβ基因敲除RBL-2H3細胞系的構建

將重組質?；驘o義DNA對照質粒用LipofectamineTM3000轉染入大鼠RBL-2H3細胞，用終濃度1 μg·mL-1嘌呤霉素對轉染細胞進行篩選以構建穩(wěn)定的CnAβ基因敲除細胞系。具體操作：取對數(shù)生長期的RBL-2H3細胞，以5×105cells·孔-1均勻鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h；用Opti-MEMTM培養(yǎng)基分別稀釋脂質體LipofectamineTM3000和3種等量混合的pX459-CnAβ-sgRNA質粒(敲除組/knockout，KO)或無義DNA對照pX459質粒(MOCK)后按1∶1的比例混勻，室溫靜置15 min。將配制好的“質粒-脂質體”混合物緩慢加入細胞培養(yǎng)板中，邊加邊搖勻。培養(yǎng)24 h后，去上清，每孔加入2 mL含1 μg·mL-1嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基；72 h后，更換含1 μg·mL-1嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基；待培養(yǎng)96 h后，觀察細胞存活量，并稀釋成單細胞擴大培養(yǎng)。最后，提取細胞DNA，以CnAβ基因引物(上游引物：5′-ACATGTAGGATGACTGGGTT-3′；下游引物：5′-AAGAGCAAAGGAAGGTGTTG-3′)進行PCR擴增，并對PCR擴增產物進行測序驗證，以篩選CnAβ基因敲除的RBL-2H3細胞株。

1.5 RT-PCR驗證CnAβ基因的表達

用Trizol試劑提取細胞RNA，并反轉錄成cDNA，以GAPDH基因為內參，分別對CnAβ基因和GAPDH基因進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的表達水平。RT-PCR擴增引物分別為CnAβ基因(上游引物：5′-ATACTTAGGCGGGAGAAAACC-3′，下游引物：5′-CCATACAAGCTTCATAGACC-3′)，GAPDH基因(上游引物：5′-ACTCCCTCAAGATTGTCAGC-3′，下游引物：5′-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3′)。

1.6 WST-1染色測定細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的細胞，分別稀釋成0.5×105、1.0×105，或5.0×105cells·mL-1，以100 μL·孔-1接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每個濃度設置3個重復，在405 nm處測定吸光值，此時記為0 h。然后每孔分別加入10 μL WST-1，混勻，于5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72和96 h測定吸光值(A405 nm)。

1.7 甲苯胺藍染色檢測

在24孔細胞培養(yǎng)板中加入滅菌蓋玻片，取對數(shù)生長期細胞加入培養(yǎng)孔中(2×105cells·孔-1)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，制作細胞爬片。棄上清，PBS漂洗細胞后，加入含10 μmol·L-1A23187的新鮮培養(yǎng)基刺激1.5 h。棄上清，PBS漂洗細胞，取出細胞爬片，用Carnoy液固定10 min，66%乙醇脫水10 min，0.5%醋酸處理1 min。加入0.5%甲苯胺藍染色1.5 h，蒸餾水洗滌3次，室溫干燥。用中性樹脂封片，于顯微鏡(40×)下觀察。

1.8 DNP、C48/80和LPS誘導細胞脫顆粒

取對數(shù)生長期的細胞(用于DNP-BSA刺激的細胞需用1 μg·mL-1anti-DNP IgE致敏過夜)，用HBSS緩沖液重懸計數(shù)，調整細胞密度為1×106cells·mL-1。將細胞以每孔100 μL接種于96孔 板細胞培養(yǎng)板中。用HBSS緩沖液稀釋DNP-BSA、LPS和C48/80，使其終濃度分別為DNP-BSA(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、50.00、100.00 μg·mL-1)，LPS(0.0、0.1、1.0、10.0、100.0 μg·mL-1)，C48/80(0、10、20、40、60、80、100、200 μg·mL-1)。每孔分別加入100 μL稀釋后的DNP-BSA，LPS，C48/80，空白對照加入100 μL HBSS緩沖液。置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，于1 500 r·min-14 ℃離心10 min，取上清(細胞培養(yǎng)上清液)。加入200 μL 1% NP-40細胞裂解液于細胞沉淀中，重懸細胞，室溫靜置10 min后，3 400 r·min-14 ℃離心5 min，取上清(細胞裂解上清液)。細胞脫顆粒效率采用β-氨 基己糖苷酶(β-hexosaminidase)的釋放率來表示，分別取50 μL細胞培養(yǎng)上清液、細胞裂解上清液或HBSS緩沖液(對照)于96-孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入50 μL 1 mmol·L-1p-NAG液，37 ℃孵育2 h；加入200 μL 0.1 mol·L-1碳酸鹽緩沖液終止反應，在酶標儀中測定吸光值(A405 nm)。按照如下公式計算細胞脫顆粒效率。

脫顆粒%=(A405 nm 細胞培養(yǎng)上清液-A405 nm 對照)/(A405 nm 細胞培養(yǎng)上清液+A405 nm 細胞裂解上清液-2 A405 nm 對照)×100。

1.9 統(tǒng)計學分析

試驗結果以“平均數(shù)±標準誤”表示，試驗重復3次。試驗數(shù)據(jù)采用t檢驗，*.P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 pX459-CnAβ-sgRNA載體構建

將成功轉化的候選單菌落大腸桿菌DH5α細胞提取質粒，然后用BpiⅠ 酶切候選重組質粒pX459-CnAβ-sgRNA(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3)并進行電泳檢測(圖1A)。由于外源片段的插入破壞了質粒BpiⅠ 的酶切位點，因此，不能被BpiⅠ 酶切的質粒即插入了外源DNA片段；而能被BpiⅠ 酶切的質粒則表示未插入外源DNA片段，如圖1A 中sgRNA1-P1、sgRNA3-P4。最后，挑取3個質粒(sgRNA1-P5、sgRNA2-P2和sgRNA3-P3)進行測序驗證(圖1B)，結果表明，這3種sgRNA均成功插入pX459質粒，可用于后續(xù)CnAβ基因敲除RBL-2H3細胞株的構建。

2.2 CnAβ基因敲除RBL-2H3細胞系的構建

將成功構建的pX459-CnAβ-sgRNA質粒載體用脂質體3000轉入RBL-2H3細胞中，經嘌呤霉素篩選出49個單克隆細胞株，通過DNA測序鑒定后顯示其中12個單克隆細胞株均有一定程度的敲除(圖2A)，其敲除效率為24.5%。筆者選擇敲除最多的6號克隆株(KO)作為進一步研究對象，提取該細胞株基因組DNA，經PCR擴增后顯示，與野生型(WT)和無義DNA對照(MOCK)組細胞相比，KO組細胞的CnAβ基因片段明顯變短(圖2B)，測序結果顯示，已成功敲除整個外顯子1及附近的381 bp序列片段(圖3)。為進一步了解該片段的缺失是否影響CnAβmRNA的表達，提取細胞總RNA，并反轉錄cDNA后進行RT-PCR擴增驗證，結果顯示，DNA片段缺失后CnAβ基因不能正常表達(圖4)，而野生型細胞(WT)和無義DNA對照細胞(MOCK)均正常表達，且經鈣離子載體A23187刺激前后其表達量無明顯變化，表明CnAβ基因為組成性表達，CnAβ基因敲除細胞系(KO)構建成功。

圖3 敲除細胞與野生細胞DNA序列比對

WT.野生細胞；KO.CnAβ基因敲除細胞; MOCK.無義DNA轉染細胞；0、1、3.A23187 刺激時間(h)

2.3 CnAβ基因對RBL-2H3生長的影響

為了研究CnAβ基因缺失后是否影響RBL-2H3細胞的生長，采用WST-1檢測細胞的增殖。結果如圖5所示，3種細胞以不同濃度(0.5×105、1.0×105或5.0×105cells·mL-1)接種后，細胞增殖均無顯著性差異，在24 h內均可到達生長平穩(wěn)期。結果表明，敲除CnAβ基因對RBL-2H3細胞生長無影響。

A.0.5×105 cells·mL-1；B.1.0×105 cells·mL-1；C.5.0×105 cells·mL-1; WT.野生細胞；KO.CnAβ基因敲除細胞; MOCK.無義DNA轉染細胞

2.4 CnAβ基因對RBL-2H3細胞顆粒含量的影響

為了研究CnAβ基因缺失對RBL-2H3細胞內顆粒形成的影響，本試驗首先通過制作細胞爬片，利用鈣離子載體A23187刺激細胞1.5 h后經甲苯胺藍試劑染色觀察(圖6)。結果顯示，3種細胞在靜息狀態(tài)下均較飽滿，邊緣整齊，染色較深，且3種細胞沒有明顯差異；當細胞脫顆粒后，細胞變大、變圓，細胞膜邊緣不整齊，細胞質變得稀疏，染色變淺，并出現(xiàn)很多空泡結構，但3種細胞結構無明顯差異。進一步檢測經A23187刺激后細胞的β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)釋放率(圖7)，結果顯示，3種細胞β-氨基己糖苷酶釋放率無顯著差異。上述結果表明，CnAβ基因缺失不影響RBL-2H3細胞顆粒的形成和顆粒的含量。

圖6 A23187誘導前后3種細胞的形態(tài)(40×)

圖7 10 μmol·L-1 A23187刺激細胞脫顆粒

2.5 CnAβ基因對RBL-2H3細胞脫顆粒的影響

由于A23187是鈣離子載體，其作用原理是在增加細胞內的鈣離子濃度從而激活細胞，而不是通過細胞表面的受體信號調節(jié)。因此，為了進一步研究CnAβ基因對RBL-2H3細胞表面受體調節(jié)細胞脫顆粒的影響，筆者選擇了C48/80、IgE/DNP-BSA和LPS作為刺激物檢測細胞表面受體信號調節(jié)細胞脫顆粒的影響。結果顯示，C48/80、IgE/DNP-BSA和LPS刺激RBL-2H3細胞脫顆粒效應均存在劑量效應(圖8A、C、E)，且C48/80的最佳刺激濃度為100 μg·mL-1(圖8A)，DNP-BSA的最佳刺激濃度為10.00 μg·mL-1(圖8C)，LPS的最佳刺激濃度為1.0 μg·mL-1(圖8E)。LPS刺激RBL-2H3細胞脫顆粒效應顯著低于C48/80和IgE/DNP-BSA刺激。3種刺激因子分別刺激3種細胞，野生型細胞(WT)和無義DNA突變細胞(MOCK)脫顆粒效應無顯著差異，但均顯著高于CnAβ基因缺失細胞(KO)的脫顆粒效應。進一步檢測了3種刺激因子在最佳刺激濃度下的刺激時間效應，發(fā)現(xiàn)3種刺激因子均存在刺激時間依賴性，刺激60 min后，細胞脫顆粒效應均達到峰值(圖8B、D、F)；與劑量效應類似，野生型細胞(WT)和無義DNA突變細胞(MOCK)脫顆粒效應無顯著差異，但均顯著高于CnAβ基因缺失細胞(KO)的脫顆粒效應。綜上表明，CnAβ基因缺失顯著抑制了RBL-2H3細胞表面受體信號介導的細胞脫顆粒效應。

A.C48/80刺激細胞脫顆粒的濃度效應; B.100 μg·mL-1 C48/80刺激細胞脫顆粒的時間效應; C.DNP刺激細胞脫顆粒的濃度效應; D.10 μg·mL-1 DNP刺激細胞脫顆粒的時間效應; E.LPS刺激細胞脫顆粒的濃度效應; F.1 μg·mL-1 LPS刺激細胞脫顆粒的時間效應.*.P<0.05; **.P<0.01

3 討 論

本研究成功構建了CnAβ基因缺失的RBL-2H3細胞株，CnAβ基因的缺失并不影響RBL-2H3細胞的生長繁殖、細胞顆粒的形成和顆粒的含量，但顯著抑制了細胞表面受體介導的細胞脫顆粒效應。這表明，CnAβ基因在細胞表面受體介導的肥大細胞脫顆粒效應的信號通路中起著關鍵作用，為肥大細胞脫顆粒的分子機制研究提供了研究基礎，同時，為過敏性疾病的防治提供了研究靶點。

利用CRISPR/Cas9質粒構建基因缺失型細胞株已經被廣泛應用[27]，但應用在免疫細胞的基因突變還比較少。本文利用CRISPR/Cas9質粒對RBL-2H3細胞進行CnAβ基因的敲除，但敲除效率較低，僅24.5%。這可能是由于免疫細胞具有自我保護機制，外源物質在細胞內更容易被降解。

鈣調磷酸酶是一種參與多種細胞功能調節(jié)的多功能信號酶，主要通過調節(jié)轉錄因子NFAT和NF-κB的活性參與到細胞信號轉導過程[20]。但鈣調磷酸酶是否參與肥大細胞脫顆粒過程并不清楚。本研究結果說明,CnAβ基因不參與肥大細胞顆粒的形成，但廣泛參與由細胞表面受體介導的肥大細胞脫顆粒過程。肥大細胞激活有IgE依賴性和IgE非依賴性兩種模式。IgE通過與其受體FcεRI特異性結合發(fā)揮作用，是肥大細胞最常見的一種激活方式，同時也是IgE介導過敏反應的基礎[28]。C48/80(Compound 48/80)是N-甲基-對甲氧基苯乙胺和甲醛縮合產生的多聚體混合物，可激發(fā)Gi-蛋白依賴的肥大細胞脫顆粒，有效地活化肥大細胞[29]。研究表明，對大鼠進行腹腔注射C48/80或直接刺激RBL-2H3細胞可引起大鼠肥大細胞脫顆粒釋放組胺和β-氨基己糖苷酶[30-31]。脂多糖(LPS)是一種存在于革蘭陰性菌胞壁的多糖，研究發(fā)現(xiàn)，LPS可通過結合細胞表面受體TLR(toll like receptor)免疫刺激后可誘導肥大細胞脫顆粒，釋放組胺和β-氨基己糖苷酶，以及炎性因子IL-1、1L-6和TNF-α等[5, 32]。β-氨基己糖苷酶是肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫顆粒后釋放的一種預合成物質。只有機體過敏時才會引發(fā)血漿中β-氨基己糖苷酶的含量明顯升高，可以作為肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象的標志物[33]。本研究通過檢查β-氨基己糖苷酶的釋放率，證明了CnAβ基因參與調控FcεRI、Gi-蛋白和TLR介導的肥大細胞脫顆粒過程，也表明CnAβ基因在一定程度上調節(jié)了機體的免疫反應。

4 結 論

成功構建了CnAβ基因敲除RBL-2H3細胞系，CnAβ基因缺失不影響肥大細胞的生長、細胞內顆粒的形成和顆粒的含量，但CnAβ基因缺失嚴重抑制了經細胞表面受體信號誘導的肥大細胞脫顆粒效應，表明CnAβ基因參與調節(jié)肥大細胞的脫顆粒過程。