衛(wèi)修來，盧雨晴，程鋼

1 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230022

2 安徽省六安市人民醫(yī)院 安徽六安 237000

茯苓為多孔菌科真菌茯苓（Poriacocos （Schw.）Wolf）的干燥菌核，味甘、淡，性平，具有利水滲濕，健脾，寧心之功效，為中醫(yī)臨床常用藥物之一?！吨袊幍洹罚?015年版，1部）將鮮茯苓按不同部位切制，陰干后，分為“茯苓塊”和“茯苓片”[1]。茯苓塊為方塊狀，較為厚；茯苓片為薄片，較茯苓塊長。茯苓的主要化學(xué)成分是多糖、三萜、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，其中茯苓多糖作為茯苓藥材的活性成分之一，具有提高機(jī)體免疫力的作用。[2]茯苓多糖包括水溶性多糖和醇溶性多糖[3-4]，臨床上通過傳統(tǒng)煎煮方法獲得的是水溶性多糖，本次實驗以水溶性多糖為指標(biāo)，考察煎煮時間對兩種不同規(guī)格的茯苓飲片中水溶性多糖溶出的影響，這在一定程度上影響了茯苓的藥效。本實驗使用苯酚-硫酸法聯(lián)合3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[5-8]測定茯苓中水溶性多糖含量，苯酚-硫酸法測總糖含量，DNS法測單糖含量，二者之差為茯苓多糖含量。利用上述方法對茯苓飲片的2種規(guī)格（茯苓塊和茯苓片）不同煎煮時間水煎液中茯苓多糖含量進(jìn)行考察，以此為中藥飲片的臨床使用提供參考。

儀器與試藥

1 儀器

TU-1810型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；2104型電子天平（上海天平儀器廠）；德爾（Deer）DH64型電熱恒溫干燥箱（上海醫(yī)療器械七廠）；H.H.S21-4型電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）； SZ-1型快速混勻器（金壇市華峰儀器有限公司）。

2 試藥

茯苓塊（安徽井泉中藥有限公司，產(chǎn)地安徽，批號為20180701、20180801、20180901，對應(yīng)編號為A、B、C）；茯苓片（安徽井泉中藥有限公司，產(chǎn)地安徽，批號為20180301、20180401、20180701，對應(yīng)編號為D、E、F），經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院葛朝亮副主任中藥師鑒定為茯苓塊和茯苓片，符合2015版《中國藥典》一部規(guī)定。葡萄糖對照品（批號：10042112，上海源葉生物科技有限公司）；苯酚（批號：20150503，上海聚泰特種試劑有限公司，分析純）；硫酸（批號：180504，無錫市展望化工試劑有限公司，分析純）；3，5-二硝基水楊酸（批號：14147181，廣州和為醫(yī)藥科技有限公司，分析純）；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

方法與結(jié)果

1 葡萄糖對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.01g，置100mL量瓶中，以水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.1g/L的葡萄糖對照品溶液①；同法制備濃度為1.0 g/L的葡萄糖對照品溶液②。

2 供試品溶液的制備

稱取各批次飲片各50 g，置2000 mL不銹鋼量杯中，加10倍量蒸餾水，浸泡30 min后置電磁爐上，大火煮沸后分別保持微沸15 min，30 min，45 min，趁熱以2層紗布過濾；各組藥渣再以8倍量蒸餾水大火煮沸保持微沸15 min，趁熱2層紗布過濾；合并兩次濾液，放至室溫，轉(zhuǎn)移至1000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，得濃度為0.05 g/mL的茯苓飲片水煎液。

3 苯酚-硫酸法測定水煎液中總糖含量

3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取0.1g/L的葡萄糖對 照 品 溶 液 各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置 于6個10 mL刻度試管中，分別加水至1mL，精密加入5%苯酚溶液2mL，立即用快速混勻器混勻，以單標(biāo)線移液管迅速加入5 mL硫酸，移液管硫酸流盡后靠壁15s，取出移液管，混勻后置于沸水浴中加熱15 min，迅速取出，置于冰水中冷卻3 min，取出混勻并放至室溫。以0 mL溶液為空白，在490 nm波長測定吸光度，以濃度C （μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A = 0.0072C + 0.0161（r=0.9997），結(jié)果表明葡萄糖濃度為21～75μg/mL時線性關(guān)系良好。

3.2 精密度試驗 精密移取茯苓總糖提取液0.5 mL、，加水補(bǔ)足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，依次連續(xù)測定6次吸光度，結(jié)果RSD為0.46%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗 精密移取茯苓總糖提取液0.5 mL，加水補(bǔ)足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，在0、20、40、60、80、100、120 min測定吸光度，結(jié)果RSD分別為0.34%，表明茯苓總糖提取液中總糖顯色后在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗 分別精密移取同一批次6份茯苓總糖提取液0.5 mL，加水補(bǔ)足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，測定吸光度，結(jié)果RSD分別為0.57%，表明苯酚-硫酸法的重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的茯苓總糖提取液28.755μg，平行6份，分別精密加入0.1g/L的葡萄糖對照品溶液28.000μg，加水補(bǔ)足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，于490nm波長下測定吸光度并計算回收率，平均回收率（n=6）為102.70%，RSD為1.23%，符合測定要求。見表1。

3.6 不同煎煮時間的茯苓總糖含量測定 分別精密吸取各批次傳統(tǒng)湯劑0.2mL于10mL量瓶中，加水稀釋至1mL，分別按照“3.1”項下方法操作，測定各批次傳統(tǒng)湯劑的吸光度，根據(jù)苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度，計算各批次茯苓傳統(tǒng)湯劑中總糖的含量。

4 DNS法測定水煎液中單糖含量

表1 苯酚-硫酸法加樣回收率考察

4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取1.0 g/L的葡萄糖對照品溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL于10 mL量瓶中，加水補(bǔ)足至2.0 mL，搖勻，分別精密加入DNS試液3.0 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱5 min，取出，迅速流水冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻。[9]以0 mL溶液為空白，在540 nm波長下測定吸光度，以濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A = 0.0182C- 0.1354 （r= 0.9999），結(jié)果表明葡萄糖濃度為20～51μg /mL時線性關(guān)系良好。

4.2 精密度試驗 精密移取茯苓總糖提取液2.0 mL，按照“4.1”項下方法操作，依次連續(xù)測定6次吸光度，結(jié)果RSD為0.37%，表明儀器精密度良好。

4.3 穩(wěn)定性試驗 精密移取茯苓總糖提取液2.0 mL，按照 “4.1”項下方法操作，在0、20、40、60、80、100、120 min測定吸光度，結(jié)果RSD為0.80%，表明茯苓總糖提取液中單糖顯色后在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.4 重復(fù)性試驗 分別精密移取6份茯苓總糖提取液2.0 mL，按照 “4.1”項下方法操作，測定吸光度，結(jié)果RSD分別為0.46%，表明DNS法的重復(fù)性良好。

4.5 加樣回收率 精密吸取已知含量的茯苓總糖提取液178.479μg，平行6份，分別精密加入1.0g/L的葡萄糖對照品溶液160.000μg，加水補(bǔ)足至2.0 mL，按照 “4.1”項下方法操作，于540nm波長下測定吸光度并計算回收率，平均回收率（n=6）為101.06%，RSD為和1.15%，符合測定要求。見表2。

表2 DNS法加樣回收率考察

4.6 不同煎煮時間的茯苓單糖含量測定 分別精密吸取各批次傳統(tǒng)湯劑0.5mL于10mL量瓶中，加水稀釋至2mL，分別按照“4.1”項下方法操作，測定各批次傳統(tǒng)湯劑的吸光度，根據(jù)DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度，計算各批次茯苓傳統(tǒng)湯劑中單糖的含量。

5 不同煎煮時間下茯苓多糖含量測定結(jié)果

茯苓片與茯苓塊測定結(jié)果見表3，表4。結(jié)果表明，茯苓飲片傳統(tǒng)湯劑中茯苓多糖含量隨煎煮時間的增加而增加，且煎煮45 min時茯苓片煎煮液中茯苓多糖含量與茯苓塊煎煮液相比無明顯差異，見圖1。

表3 不同煎煮時間下茯苓塊水煎液中茯苓多糖的含量

表4 不同煎煮時間下茯苓片水煎液中茯苓多糖的含量

討 論

圖1 不同煎煮時間下茯苓塊與茯苓片水煎液中多糖含量（■茯苓塊 ●茯苓片）

本實驗通過對茯苓飲片的15，30，45min3個不同煎煮時間進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)煎煮45min的茯苓傳統(tǒng)湯劑中茯苓多糖含量明顯較高，且煎煮15min的水煎液中茯苓多糖含量最小。根據(jù)圖1可知，茯苓水煎液在煎煮30～45min過程中，茯苓多糖增長率明顯低于煎煮15～30min。

在實驗研究初期，我們曾參照文獻(xiàn)嘗試采用了80%乙醇除雜過濾，再水提多糖以硫酸-苯酚法或硫酸-蒽酮法測定多糖[10]，但因為茯苓中水溶性多糖含量很低（＜0.3%），往往需要較大的取樣量（≥2g），這樣在除雜過濾時較慢，吸附在殘渣上的單糖不易洗凈除去，從而使結(jié)果的重復(fù)性較差，不易獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。而另一種方法水提醇沉也需要多糖含量較高才能夠沉淀出來，少量的沉淀較為松散而易隨乙醇流失，在茯苓多糖的提取中顯然不具備優(yōu)勢。本實驗采用的多糖含量測定方法為：水提總糖，測其總糖及單糖含量，兩者之差為多糖含量。本方法只需一次提取，避免因多次提取及轉(zhuǎn)移過濾造成的多糖損失，同時解決了因多糖含量較少而無法采用水提-醇沉法提取的問題，既保證了提取的充分，又大大減少了操作步驟及時間，且使整體實驗操作誤差減小。

DNS法作為茯苓單糖含量的測定方法，使用前需按紫外-可見分光光度法方法測定，在200～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明樣品溶液最大吸收波長為505nm。在含量測定的實驗過程中，505nm波長下樣品溶液及空白對照所測吸光度均不穩(wěn)定，推測該波長下溶液發(fā)生某種可逆的物理或化學(xué)變化。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)及報道，最終確定測量波長為540nm，[11]此時樣品溶液吸光度穩(wěn)定且重復(fù)性和精密度均較好。

綜上所述，茯苓作為常用中藥，對不同煎煮時間傳統(tǒng)湯劑中多糖含量的考察在臨床用藥中有著較重要的意義。通過本實驗的初步探索可知，茯苓片水煎液中茯苓多糖與茯苓塊水煎液相比無明顯差異，且茯苓飲片在煎煮45 min時水煎液中茯苓多糖的含量最高。因此，在臨床上，茯苓塊和茯苓片均可作為茯苓飲片的常用規(guī)格使用；另一方面，在日常煎藥時，可在不影響其他藥材有效成分煎出的前提下適當(dāng)增加煎煮時間。