潘艷杰，張海濤，查俊華，段 柯，劉向玲(.鄭州頤和醫(yī)院眼科，鄭州 450000；.河南省人民醫(yī)院眼科，鄭州 450000；.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科，鄭州 450000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病(DM)最常見的微血管并發(fā)癥，也是成人視力喪失的主要原因，嚴(yán)重危害人類的視力健康[1]。通過早期篩查，及早控制血糖，采用藥物干預(yù)，對(duì)于減緩DR發(fā)展、維持視力具有積極意義。芪明顆粒(QM)是臨床實(shí)踐中研究出的一種新藥，具有益氣生津、滋肝養(yǎng)腎、通絡(luò)明目的功效；主治肝腎不足、氣陰兩虧、目絡(luò)瘀滯等癥[2-3]。QM采用辨證分型，分期論治，能夠減輕視網(wǎng)膜損傷，改善視網(wǎng)膜病變，臨床上用于治療DR，療效確切[4]。但其具體作用機(jī)制研究較少，本研究通過觀察其對(duì)DR大鼠炎癥的改善作用探討其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用該藥治療DR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1儀器與材料

1.1.1儀器 YZ5E裂隙燈和手持檢眼鏡，均購自蘇州六六視覺科技股份有限公司；One touch血糖儀和血糖試紙，均購自美國強(qiáng)生Lifescan公司；Mini-Protean4電泳儀，購自美國BioRad公司。

1.1.2試藥 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；芪明顆粒(國藥準(zhǔn)字Z20090036，浙江萬晟藥業(yè)有限公司，規(guī)格：4.5 g×15袋)；大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和C反應(yīng)蛋白(CRP)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒，均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；多聚甲醛、二甲苯和乙醇，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊巴比妥鈉(上海紫一試劑廠)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖鹽溶液(TBS,上海源葉生物科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA,蛋白檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；兔抗大鼠高遷移率族蛋白1(HMGB-1)多抗(美國Cell Signaling Technology公司);兔抗大鼠Toll樣受體4(TLR4)多抗、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)多抗、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)和末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡試劑盒,均購自美國Abcam公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠55只，雄性，8周齡，體質(zhì)量為(200±20) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。購入后保持相對(duì)濕度為60%±10%，溫度為(23±1) ℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2方法

1.2.1建模、分組及干預(yù) 取100 mg STZ，用0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶解，4 ℃保存?zhèn)溆?。隨機(jī)取45只大鼠，禁食不禁水12 h后，采用一次腹腔注射STZ溶液(60 mg·kg-1)誘導(dǎo)DM模型，72 h后，尾靜脈測(cè)血糖，以血糖值≥16.7 mmol·L-1為建模成功，繼續(xù)飼喂12周，每周測(cè)量大鼠血糖值，考察血糖穩(wěn)定性。將40只成模DM大鼠隨機(jī)分為DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組，每組10只。按照人與大鼠體表面積折算給藥劑量，QM低劑量組和QM高劑量組分別按1.2、2.4 g·kg-1灌胃QM，陽性對(duì)照組按照40 mg·kg-1灌胃辛伐他汀，DR組灌胃等體積生理鹽水。剩余10只大鼠作為對(duì)照組，灌胃等體積生理鹽水。所有大鼠干預(yù)頻次：每日1次，連續(xù)6周。

1.2.2檢測(cè)血清炎癥因子水平 末次給藥后12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉大鼠，腹腔靜脈采血5 mL，以3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑為10 cm，取上清，采用ELISA法測(cè)定血清中IL-6、TNF-α和CRP水平，經(jīng)包被、洗滌、封閉、加樣、顯色和終止反應(yīng)后，在450 nm波長處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值A(chǔ)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中IL-6、TNF-α和CRP水平。

1.2.3HE染色觀察視網(wǎng)膜病變 采血完畢后處死大鼠，摘取雙側(cè)眼球，分離左側(cè)視網(wǎng)膜，于體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中固定24 h，采用梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，片厚約3 μm，常規(guī)HE染色后，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，鏡檢。

1.2.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取視網(wǎng)膜切片，常規(guī)脫蠟，用酒精水化，用體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫封閉5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)緩沖液濕盒37 ℃反應(yīng)60 min，抗地高辛抗體濕盒反應(yīng)30 min，免疫組織化學(xué)(SABC)法染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明后進(jìn)行封片。鏡下觀察計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)凋亡數(shù)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5Wetern Blot檢測(cè)視網(wǎng)膜蛋白表達(dá) 分離右側(cè)視網(wǎng)膜，保存于液氮中。取視網(wǎng)膜80 mg，加入裂解液，離心取上清，BCA法測(cè)定樣品中蛋白含量，加入5倍上樣緩沖液，沸水煮5 min使蛋白變性失活，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，稀釋比例：Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、HMGB1(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，TBS溶液洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBS溶液洗膜3次，加入ECL發(fā)光液，曝光、顯影，分析數(shù)據(jù)，比較各條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1治療前后血糖比較 與對(duì)照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組治療前、治療后血糖水平均升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組治療后血糖水平降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對(duì)照組治療后血糖水平降低(P<0.05)。DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組治療前血糖水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；QM高劑量組和陽性對(duì)照組治療后血糖水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 血糖水平比較Tab.1 Comparison of blood sugar levels

2.2血清IL-6、TNF-α和CRP水平比較 與對(duì)照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平均升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平均降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對(duì)照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平均降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對(duì)照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 血清IL-6、TNF-α和CRP水平比較Tab.2 Comparison of serum IL-6，TNF-α and CRP levels

2.3HE染色觀察視網(wǎng)膜病理學(xué)變化 對(duì)照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整，分層清楚，各層細(xì)胞排列緊密，RGCs數(shù)量較多，形狀規(guī)則，排列整齊；DR組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞，RGCs數(shù)量減少，部分細(xì)胞可見空泡樣變性，出現(xiàn)異形細(xì)胞，內(nèi)核層、外核層細(xì)胞排列紊亂，數(shù)量減少；QM各劑量組及陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較DR組有所改善，各層細(xì)胞排列較規(guī)則，RGCs異形細(xì)胞減少，內(nèi)核層和外核層細(xì)胞排列較規(guī)則，數(shù)量較多，其中QM高劑量組和陽性對(duì)照組改善效果明顯。見圖1。

圖1 視網(wǎng)膜病理學(xué)變化注：A.對(duì)照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對(duì)照組；HE×400。Fig.1 Pathological changes of the retinaNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group;HE×400.

2.4RGCs凋亡指數(shù)比較 對(duì)照組、DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組RGCs凋亡指數(shù)分別為3.24%±0.75%、22.56%±1.52%、11.27%±1.14%、7.67%±1.07%、7.16%±1.18%。與對(duì)照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組凋亡指數(shù)均升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組凋亡指數(shù)均降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對(duì)照組凋亡指數(shù)均降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對(duì)照組凋亡指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 RGCs凋亡情況注：A.對(duì)照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對(duì)照組；TUNEL×400。Fig.2 Apoptosis of RGCsNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group;TUNEL×400.

2.5視網(wǎng)膜中凋亡相關(guān)蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中Bcl-2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax均降低，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中Bcl-2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax升高，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中Bcl-2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax升高，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3和圖3。

圖3 視網(wǎng)膜中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)注：A.對(duì)照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對(duì)照組。Fig.3 Bcl-2 and Bax protein expression in the retinaNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group.

表3 視網(wǎng)膜中Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax水平比較Tab.3 Comparison of Bcl-2，Bax，Bcl-2/Bax levels in the retina n=10)

2.6視網(wǎng)膜中HMGB1/TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4和圖4。

表4 視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR4和NF-κB水平比較Tab.4 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB levels in the retina

圖4 視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)注：A.對(duì)照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對(duì)照組。Fig.4 HMGB1，TLR4 and NF-κB protein expression in the retinaNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group.

3 討論

DR的主要病理學(xué)變化表現(xiàn)為RGCs凋亡、視網(wǎng)膜神經(jīng)功能障礙和新生血管生成等[5-6]。發(fā)生DM后，血糖控制不佳，視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺氧，IL-6、TNF-α和CRP表達(dá)增加，引起血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞大量浸潤，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，最終形成DR[7-8]。DR的發(fā)生、發(fā)展與炎癥密切相關(guān)，大量抗炎治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，降低炎癥反應(yīng)能有效抑制DR發(fā)展[9-11]。

單純控制血糖不能完全阻止DR發(fā)展，需要通過藥物治療。中醫(yī)認(rèn)為，DM屬于“消渴病”范疇，因消渴引起眼部功能改變，導(dǎo)致視力降低甚至喪失，證見頭暈耳鳴、目睛干澀和視物昏花等[12]。DR的基本病機(jī)為氣陰兩虛、肝腎不足，因虛致淤導(dǎo)致目絡(luò)阻滯，治療該病應(yīng)補(bǔ)氣生津、滋養(yǎng)肝腎，標(biāo)本兼治[13-14]。QM是臨床實(shí)踐研制的一種新藥，由黃芪、葛根、地黃、枸杞、決明子、茺蔚子、蒲黃和水蛭8種中藥制成，有滋肝養(yǎng)腎、益氣活血作用。黃芪益氣升陽、活血化瘀，葛根生津止渴、清熱涼血，二者合用益氣生津，補(bǔ)而不滯，共為君藥。地黃滋陰養(yǎng)血，枸杞補(bǔ)肝明目，為臣藥，輔助君藥益氣養(yǎng)陰。決明子明目助眠，茺蔚子活血補(bǔ)陰，蒲黃通淋化瘀，水蛭破血逐淤，諸藥合用，共奏活血止血、祛瘀生新、清熱明目之功效。李云等[15]研究表明，QM聯(lián)合百令膠囊用于早期慢性腎臟病，可抑制炎癥反應(yīng)，改善腎功能。王軍媛等[16]研究顯示，QM治療糖尿病腎病早期患者，炎癥因子水平及尿蛋白明顯低于對(duì)照組，療效確切。本研究采用QM治療DR大鼠，血糖水平及IL-6、TNF-α和CRP等炎癥因子水平明顯降低，RGCs細(xì)胞凋亡減少，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有所改善，且QM高劑量組與陽性藥物效果相當(dāng)，提示QM治療DR大鼠能減少炎癥反應(yīng)，保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能。

HMGB1是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷或應(yīng)激等刺激時(shí)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HMGB1，募集活化免疫細(xì)胞，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)[17]。HMGB1可作為TLR4的內(nèi)源性配體，釋放到胞外后通過與TLR4結(jié)合，激活下游NF-κB，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。臨床研究顯示，HMGB1/TLR4/NF-κB通路在糖尿病腎病患者中高表達(dá)，其釋放的炎癥因子能夠促進(jìn)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重糖尿病視網(wǎng)膜病變[18-19]。實(shí)驗(yàn)性腦外傷大鼠中，小膠質(zhì)細(xì)胞激活誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可通過阻滯HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路得到抑制[20]。另外，有研究證實(shí)，HMGB1在多種疾病中表達(dá)顯著升高，本研究中，DR組HMGB1、TLR4和NF-κB表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與DR的發(fā)生、發(fā)展，經(jīng)QM治療后，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax升高，Bax表達(dá)降低，HMGB1、TLR4和NF-κB表達(dá)降低，且QM高劑量組與陽性對(duì)照組效果相當(dāng)，提示QM可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，減少RGCs凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜。

綜上所述，QM可改善DR大鼠的炎癥反應(yīng)，減少RGCs凋亡，可能是通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，為臨床治療DR奠定了基礎(chǔ)。