正相高效液相色譜法同時(shí)測定肉制品中4 種羥基十八碳二烯酸異構(gòu)體的含量

劉 婷，熊 強(qiáng)，耿志明，徐為民,3

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

脂質(zhì)氧化貫穿肉制品加工整個(gè)過程，對肉制品、尤其是腌臘肉制品風(fēng)味的形成具有重要影響[1-2]，并且脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的產(chǎn)物也會(huì)引起肉制品中其他組分的變化，降低肉制品的營養(yǎng)價(jià)值[3-4]。亞油酸是肉制品中最常見的多不飽和脂肪酸，在脂肪氧合酶、過渡金屬離子以及自由基等作用下[5-7]，亞油酸首先被氧化形成初級氧化產(chǎn)物ü ü 氫過氧化十八碳二烯酸（hydroperoxyoctadecadienoic acids，HPODEs）[8]。由于存在共軛雙鍵，HPODEs有4 種異構(gòu)體：13-9Z,11E-氫過氧十八碳二烯酸、13-9E,11E-氫過氧十八碳二烯酸、9-10Z,12E-氫過氧十八碳二烯酸和9-10E,12E-氫過氧十八碳二烯酸。HPODEs性質(zhì)活潑，在谷胱甘肽過氧化物酶或過渡金屬離子等作用下還原形成亞油酸的次級氧化產(chǎn)物ü ü 羥基十八碳二烯酸（hydroxyoctadecadienoic acids，HODEs）[9]。還原反應(yīng)不改變共軛雙鍵的異構(gòu)現(xiàn)象[10]，因此存在相應(yīng)的4 種HODEs異構(gòu)體，分別為13-羥基-9Z,11E-十八碳二烯酸（13-hydroxy-9Z,11Eoctadecadienoic acid，13-Z,E-HODE）、13-羥基-9E,11E-十八碳二烯酸（13-hydroxy-9E,11E-octadecadienoic acid，13-E,E-HODE）、9-羥基-10Z,12E-十八碳二烯酸（9-hydroxy-10Z,12E-octadecadienoic acid，9-Z,EHODE）、9-羥基-10E,12E-十八碳二烯酸（9-hydroxy-10E,12E-octadecadienoic acid，9-E,E-HODE）。HODEs異構(gòu)體的種類及比例取決于亞油酸氧化的途徑，自由基誘導(dǎo)的自動(dòng)氧化途徑產(chǎn)生4 種HODEs異構(gòu)體；而脂肪氧合酶催化的酶促途徑只會(huì)產(chǎn)生13-Z,E-HODE和9-Z,E-HODE兩種異構(gòu)體[11]。

人體內(nèi)存在內(nèi)源性的HODEs，是體內(nèi)亞油酸的代謝產(chǎn)物之一[12]。研究表明，內(nèi)源性HODEs具有病理生理學(xué)作用，但不同位置異構(gòu)體的作用有所差異。如13-HODE對早期動(dòng)脈粥樣硬化具有延緩作用，而9-HODE則在動(dòng)脈粥樣硬化晚期表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用[13]；在皮膚相關(guān)疾病的發(fā)展中，9-HODE表現(xiàn)為促炎作用[14]，而13-HODE則表現(xiàn)為抗炎作用[15]。原發(fā)性高血壓病人體內(nèi)13-HODE的水平顯著高于正常人群[16]，13-HODE還被認(rèn)為與人類多種癌癥的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)[17-18]。通過研究異構(gòu)體種類、含量變化等，內(nèi)源性HODEs已被作為脂質(zhì)代謝指示物，廣泛用于人類多種相關(guān)疾病的病理生理學(xué)研究[12,19]。

近年來加工肉制品的安全問題受到了人們的廣泛關(guān)注[20]。研究發(fā)現(xiàn)，加工肉制品普遍含有包括HODEs在內(nèi)的多種亞油酸的次級氧化產(chǎn)物[21-22]。尤其值得關(guān)注的是，這些外源性的亞油酸次級氧化產(chǎn)物可通過膳食被人體直接吸收，具有內(nèi)源性亞油酸次級氧化產(chǎn)物相同的作用[23]。因此對加工肉制品中4 種HODEs異構(gòu)體含量同時(shí)進(jìn)行分析，可以完整地了解不同異構(gòu)體在肉制品中的存在水平，為進(jìn)一步開展暴露評估提供數(shù)據(jù)，也為探索肉制品中HODEs主要形成途徑、以及相應(yīng)的調(diào)控工藝的研發(fā)打下基礎(chǔ)。

HODEs的分析方法主要有高效液相色譜-紫外（high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLC-UV）檢測法[24-25]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[26]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）聯(lián)用[27-28]以及酶聯(lián)免疫吸附[29]等方法。這些方法滿足各類樣本（組織、血漿、食品等）中HODEs的分析，但多側(cè)重于單一HODE（如13-HODE）或HODEs總量分析，同時(shí)分析食品中4 種HODEs異構(gòu)體含量的研究鮮見報(bào)道。肉制品中普遍存在的高含量HODEs以及HODEs中存在的共軛雙鍵，使得運(yùn)用HPLC-UV建立同時(shí)分析肉制品中4 種HODEs異構(gòu)體含量的方法成為可能。

本實(shí)驗(yàn)利用硅膠柱為分離柱、利用二極管陣列檢測器（photo diode array，PDA）在234 nm波長處檢測4 種HODEs異構(gòu)體，建立同時(shí)測定肉制品中13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE含量的正相高效液相色譜-二極管陣列檢測器（high performance liquid chromatography-photo diode array detector，HPLC-PDA）分析方法，以期用于肉制品中HODEs形成規(guī)律及機(jī)制相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生腌肉制品S 1 ～S 11、即食肉制品S 1 2 ～S 1 8江蘇省南京市蘇果超市及農(nóng)貿(mào)市場；標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg/mL 13-Z,E-HODE、0.1 mg/mL 9-Z,E-HODE 美國Cayman Chemicals公司；0.2 mg/mL 13-E,E-HODE、0.2 mg/mL 9-E,E-HODE 瑞典Larodan公司；Sep-Pak C18固相萃取柱（500 mg/3 mL） 美國Waters公司；正己烷、異丙醇（均為色譜純） 美國ROE公司；乙酸（色譜純）美國Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695 HPLC儀（配有PDA） 美國Waters公司；T25高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；Biofugestratos高速離心機(jī) 德國Heraeus公司；氮吹儀 美國Organomation公司；超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量體積質(zhì)量濃度分別為1.0、0.2、0.1、0.2 mg/mL的13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE標(biāo)準(zhǔn)溶液，于氮吹儀中氮吹至干，分別加入正己烷配制成質(zhì)量濃度分別為20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-40 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 樣品處理

樣品處理方法參考姜春嬌等[30]的方法。將肉制品分別切碎后，密封貯存于-18 ℃?zhèn)溆?。稱取2.0 g（精確到0.01 g）肉樣于80 mL離心管中，加入15 mL甲醇，使用勻漿機(jī)5 000 r/min均質(zhì)2 min，加入10 mL超純水，渦旋混勻后3 500hg離心12 min。Sep-Pak C18固相萃取柱（500 mg/3 mL）預(yù)先用3 mL甲醇進(jìn)行活化、3 mL水平衡，然后取5 mL上清液過C18小柱，再采用2 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液氮吹至干，最后采用200 μL正己烷（對于HODEs含量較高的樣品，應(yīng)適當(dāng)增加正己烷的用量以保證目標(biāo)分析物的檢測濃度處于線性范圍內(nèi)）溶解HODEs，過0.22 μm濾膜后用于HPLC-PDA分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Absolute SiO2（250 mmh 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：正己烷-異丙醇-乙酸（98.3∶1.6∶0.1，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測器：PDA；檢測波長：234 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.4.1 線性范圍、線性回歸方程及檢出限和定量限

取適量體積1.3.1節(jié)制備的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合，采用正己烷逐級稀釋配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行HPLC-PDA分析，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測定3 次。以4 種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)y，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。取標(biāo)準(zhǔn)HODEs溶液用正己烷逐級精密稀釋，依次進(jìn)樣，以3 倍信噪比（RSN＝3）時(shí)的HODEs質(zhì)量濃度作為檢出限，以10 倍信噪比（RSN＝10）時(shí)的HODEs質(zhì)量濃度作為定量限。

1.3.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取3 種樣品（S2、S5、S18），按照1.3.2節(jié)進(jìn)行處理，進(jìn)行日內(nèi)與日間精密度實(shí)驗(yàn)。日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)：每種樣品重復(fù)處理6 個(gè)，在1 d內(nèi)不同時(shí)段按照1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行HPLC分析；日間精密度實(shí)驗(yàn)：每種樣品重復(fù)處理3 個(gè)，連續(xù)3 d每天按照1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行HPLC分析。分別計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

1.3.4.3 回收率實(shí)驗(yàn)

選擇3 種不同HODEs濃度水平的肉制品（S9、S12、S14）進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，分別精密加入3 個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，分別按照1.3.2節(jié)進(jìn)行處理后按1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行HPLC測定，分別計(jì)算回收率，每個(gè)添加水平做3 個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

HODEs為極性較大的羥基類脂肪酸，常用的提取溶劑有乙酸乙酯、甲醇、乙醚等。生物樣本（如血液、血漿、組織等）中的HODEs多采用經(jīng)典的液液萃取進(jìn)行提取[31]；但肉制品富含蛋白質(zhì)、脂類，雜質(zhì)較多，簡單的液液萃取難以滿足HPLC-PDA法同時(shí)測定肉制品中4 種HODEs異構(gòu)體含量的要求。本實(shí)驗(yàn)參考姜春姣等[30]的方法，采用液液萃取結(jié)合固相萃取的方法提取、凈化肉制品中4 種HODEs異構(gòu)體，并著重對固相萃取的條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 樣品提取溶劑的選擇

選擇甲醇為提取溶劑[30]，提取液中的甲醇含量同時(shí)影響HODEs、雜質(zhì)在C18小柱上的保留，高甲醇含量的提取液有利于降低雜質(zhì)在C18小柱上的保留，但也可能造成HODEs回收率降低。為了確定提取液中甲醇的最佳體積分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)以不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液（50%～80%）作為溶劑，配制質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL的4 種HODEs異構(gòu)體的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣到C18小柱，再采用2 mL甲醇進(jìn)行洗脫，觀察提取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)變化對HODEs提取回收率的影響，如圖1所示。結(jié)果表明，在甲醇體積分?jǐn)?shù)50%～65%范圍內(nèi)，HODEs的回收率均保持在90%以上，無顯著差異，但進(jìn)一步加大甲醇體積分?jǐn)?shù)，回收率顯著下降，因此本實(shí)驗(yàn)將提取液的甲醇體積分?jǐn)?shù)確定為60%。

圖1 提取液甲醇體積分?jǐn)?shù)對回收率的影響Fig.1 Effect of various methanol and water mixtures on recoveries of analytes

2.1.2 洗脫液用量的優(yōu)化

圖2 洗脫液體積對回收率的影響Fig.2 Effect of eluent volume on recoveries of analytes

為了讓吸附在小柱上的HODEs盡可能被完全洗脫，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇為HODEs的洗脫液，用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液配質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL的4 種HODEs異構(gòu)體的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣到C18小柱，觀察不同體積的甲醇溶液（0.5～3 mL）洗脫對HODEs回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著洗脫液用量加大，回收率顯著上升，當(dāng)洗脫液體積≥1.6 mL 時(shí)，HODEs的回收率沒有顯著差異（P＞0.05），均保持在90%以上。為確保HODEs完全洗脫并提高實(shí)驗(yàn)效率，本實(shí)驗(yàn)確定的洗脫液甲醇的用量為2 mL。

本實(shí)驗(yàn)建立的液液萃取結(jié)合固相萃取的樣品處理方法，可以有效去除樣品中的雜質(zhì)，避免HODEs色譜分析受雜質(zhì)干擾。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

HODEs含有共軛雙鍵，在231～235 nm波長范圍內(nèi)具有特征性紫外吸收[32]。本實(shí)驗(yàn)采用PDA在190～400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE分別在234、231、234 nm和231 nm波長處有最大吸收。為實(shí)現(xiàn)同時(shí)測定肉制品中的13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,EHODE，選擇234 nm為檢測波長。

HODEs是含有一個(gè)羥基的十八碳二烯酸，具有一定極性，可以選擇反相柱（如C18柱）或正相柱（如硅膠柱）進(jìn)行液相色譜分離。本實(shí)驗(yàn)比較了4 種HODEs異構(gòu)體在C18柱和硅膠柱上的保留行為，4 種HODEs在硅膠柱上表現(xiàn)出了更好的色譜分離效果；在選擇硅膠柱正相分離的基礎(chǔ)上，觀察流動(dòng)相中正己烷、異丙醇、乙酸組成比例對HODEs保留時(shí)間、峰形、分離度以及雜質(zhì)干擾的影響，確立流動(dòng)相中正己烷-異丙醇-乙酸體積比為98.3∶1.6∶0.1。

在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的色譜條件下，4 種HODEs異構(gòu)體均具有適中的保留時(shí)間（分別為12.55、18.17、22.31 min和24.89 min）和良好的峰形，與雜質(zhì)完全基線分離。13-Z,E-HODE（3.0 μg/mL）、13-E,E-HODE（4.2 μg/mL）、9-Z,E-HODE（6.0 μg/mL）、9-E,EHODE（2.8 μg/mL）混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖3A，一種肉制品S12中HODEs的色譜圖如圖3B所示。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）與肉樣品（B）的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of HODEs in mixed standard solution (A) and in meat sample (B)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 線性范圍、線性回歸方程及檢出限和定量限

方法的線性關(guān)系結(jié)果見表1，4 種分析物的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，在設(shè)定的范圍內(nèi)，4 種HODE的質(zhì)量濃度與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。檢出限分別為0.15、0.07、0.18、0.12 μg/mL，定量限分別為0.50、0.24、0.64、0.40 μg/mL，根據(jù)樣本處理換算，檢出限分別為0.075、0.035、0.090、0.060 μg/g，定量限分別為0.25、0.12、0.32、0.20 μg/g。

表1 HPLC法測定HODEs的線性范圍、回歸方程、檢出限以及定量限Table 1 Calibration curve equations, linear ranges, detection limits and quantification limits for HPLC analysis of HODEs

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 2 Results of precision tests (n= 3)

如表2所示，13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE的日內(nèi)RSD范圍分別為2.20%～2.52%、1.91%～2.90%、2.14%～3.09%和2.02%～2.96%；日間RSD范圍分別為1.85%～2.41%、1.97%～2.68%、1.52%～2.93%和1.88%～2.40%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的檢測方法精密度良好。

2.3.3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 不同添加水平回收率測定結(jié)果（n=3）Table 3 Recoveries of analytes at different spiked levels (n= 3)

由表3可知，13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE的回收率范圍分別為84.6%～92.7%、87.0%～91.6%、87.8%～91.5%、84.0%～90.3%，不同添加水平的平均回收率分別為89.03%、89.03%、89.33%、87.93%。表明本實(shí)驗(yàn)建立的同時(shí)測定肉制品中4 種HODEs含量的分析方法具有較好的準(zhǔn)確性。

2.4 實(shí)際樣品分析結(jié)果

利用本實(shí)驗(yàn)建立的檢測方法對市售的咸肉、臘肉、臘腸、中式火腿等18 種肉制品（其中生腌肉制品11 種，即食肉制品7 種）進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品中均含有4 種HODE，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，所有樣本均檢測出13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE。在生腌肉制品中，13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE含量范圍分別為2.78～9.10、0.85～5.79、3.45～11.02 μg/g和0.78～5.82 μg/g；即食肉制品中4 種目標(biāo)分析物的含量范圍分別為1.73～5.29、0.56～3.77、2.37～4.69 μg/g和0.84～2.41 μg/g。

生腌肉制品與即食肉制品中的HODEs含量未見顯著差異（P＞0.05），表明加工溫度對HODEs含量的影響較小，HODEs具有較好的熱穩(wěn)定性。從表4還可以看出，無論是13-HODE還是9-HODE，其中Z,E-異構(gòu)體的含量均明顯高于E,E-異構(gòu)體的含量，但18 個(gè)樣本（13-Z,E-HODE+9-Z,E-HODE）/（13-E,E-HODE+9-E,E-HODE）的比值為1.40～3.66，變化幅度較大，表明不同產(chǎn)品之間脂質(zhì)氧化途徑（酶促和非酶促氧化）對總體脂質(zhì)氧化的貢獻(xiàn)存在顯著差異。

表4 18 種肉制品中13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE的含量（，n=3）Table 4 Contents of 13-Z,E-HODE, 13-E,E-HODE, 9-Z,E-HODE and 9-E,E-HODE in 18 meat products (n= 3)

表4 18 種肉制品中13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE的含量（，n=3）Table 4 Contents of 13-Z,E-HODE, 13-E,E-HODE, 9-Z,E-HODE and 9-E,E-HODE in 18 meat products (n= 3)

注：同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

樣本 含量/（μg/g）13-Z,E-HODE 13-E,E-HODE 9-Z,E-HODE 9-E,E-HODE生腌肉制品S1 7.59f 0.06c 3.47f 0.03f 8.88f 0.06c 3.47f 0.06e S2 9.10f 0.03a 5.79f 0.05a 11.02f 0.04a 5.82f 0.03a S3 7.71f 0.09c 2.84f 0.03g 8.81f 0.10c 1.67f 0.05hi S4 3.03f 0.07l 0.85f 0.04o 5.66f 0.10f 2.43f 0.11g S5 2.78f 0.02m 1.21f 0.03m 4.05f 0.03j 1.62f 0.03i S6 5.11f 0.05g 2.84f 0.03g 6.95f 0.06d 3.38f 0.07f S7 5.94f 0.14e 1.91f 0.03i 3.45f 0.09m 0.78f 0.01l S8 6.44f 0.06d 4.65f 0.04c 6.22f 0.05e 4.13f 0.01c S9 8.13f 0.04b 4.93f 0.03b 10.44f 0.10b 4.63f 0.03b S10 3.53f 0.04j 1.79f 0.01j 3.90f 0.03k 1.34f 0.02j S11 5.88f 0.08e 3.60f 0.12e 4.83f 0.09g 3.59f 0.07d S12 4.51f 0.05h 1.67f 0.05k 4.20f 0.05i 1.66f 0.03hi S13 5.29f 0.07f 2.70f 0.05h 4.69f 0.04h 2.41f 0.03g S14 3.19f 0.03k 1.09f 0.06n 2.37f 0.02o 0.84f 0.01l S15 2.88f 0.03m 1.54f 0.03l 3.58f 0.03l 1.72f 0.02h S16 5.19f 0.06fg 3.77f 0.03d 2.42f 0.03o 1.68f 0.03hi S17 3.83f 0.11i 1.98f 0.01i 2.50f 0.03no 0.95f 0.01k S18 1.73f 0.02n 0.56f 0.01p 2.55f 0.03n 0.85f 0.02l即食肉制品

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過樣品處理?xiàng)l件和色譜條件的優(yōu)化，建立了同時(shí)測定肉制品中4 種HODEs異構(gòu)體的HPLC-PDA分析方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法操作簡便、適用性強(qiáng)，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測定肉制品中13-Z,E-HODE、13-E,E-HODE、9-Z,E-HODE和9-E,E-HODE的含量。對18 種市售肉制品的檢測結(jié)果表明，肉制品中普遍含有HODEs，其形成機(jī)制、影響因素及其潛在健康風(fēng)險(xiǎn)等值得進(jìn)一步研究。