連玉晶，周一冉，孫 欣，陳佳楠，鄭振佳，王明林

（山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018）

為了增加產(chǎn)量并改善質量，需要在農(nóng)作物上噴灑農(nóng)藥以控制病蟲害和雜草。但是，長時間的使用或濫用農(nóng)藥會引起農(nóng)藥殘留問題。在傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析方法中，樣品預處理復雜，存在試劑用量大、操作復雜、費時、易污染且難自動化的問題，一直以來是分析檢測的熱點及難點[1]。因此有必要開發(fā)簡單、經(jīng)濟、高效的農(nóng)藥殘留分析前處理方法。

QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）方法因其簡單、經(jīng)濟、高效等特性而被廣泛用做食品基質中農(nóng)藥多殘留分析的預處理方法[2]，它主要包括目標物的提取及在溶劑中的分配、共萃物的凈化及離心分離。在凈化過程中，一些傳統(tǒng)的凈化材料包括N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA）[3-4]、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）[5]和C18[6-7]等，以及一些新材料包括多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）[8]、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）[9]和二氧化鋯基吸附劑（Z-Sep）[10]等的應用，提高了分析方法的靈敏度和選擇性。這些材料可以在預處理過程中單獨或組合使用，以分析各種類型基質中的不同目標分析物[11-14]。近年來，磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）在樣品前處理中顯現(xiàn)了它的優(yōu)勢。替代分離過程中的離心操作，通過外部磁場即可實現(xiàn)吸附材料與萃取介質的分離，簡化了操作步驟并節(jié)省了分析時間；此外，納米材料比表面積大、吸附容量增加；磁性材料表面可接枝不同的功能基團如Fe3O4-MWCNTs[15]、Fe3O4/GO[16]和Fe3O4-PSA[17]等，提高了吸附的選擇性。

以胺基為功能基團接枝的磁性材料可作為有機酸的吸附劑。姜飛虹等[18]制備的Fe3O4/殼聚糖磁性微球對蘋果汁中有機酸具有良好的吸附性能。另外，胺基修飾的MNPs也可作為不同基質的凈化劑。Wang Jun等[19]以磁性超支化聚酰胺為QuEChERS方法凈化劑，建立橙汁中有機磷農(nóng)藥的檢測方法。Liu Zhenzhen等[17]用Fe3O4-PSA和C18移除谷物基質中的脂肪酸和非極性干擾物。并通過液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法同時測定了水稻中50 種農(nóng)藥和8 種相關代謝物殘留。與以非磁性材料作為凈化吸附劑的傳統(tǒng)QuEChERS方法相比，新方法可以節(jié)省30%的預處理時間。Qi Peipei等[20]用3-(N,N-二乙氨基)丙基三甲氧基硅烷改性的Fe3O4MNPs為吸附劑，開發(fā)了磁性QuEChERS方法，結合LC-MS/MS可測定蘋果、奇異果、橙子和梨中的56 種農(nóng)藥殘留。檢測目標物的線性范圍在2～200 ng/mL之間，相關系數(shù)（r）在0.943 4～0.999 3之間；添加回收率在60.2%～130%范圍內，定量限為10 ng/kg。

果蔬基質中極性干擾物較多，為了達到更好的凈化目的，提高方法的靈敏度及選擇性，本研究將3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基（3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino] propyltrimethoxy，PAAA）接枝到磁性材料表面，可以提供較大的極性基團，增強對基質中極性干擾物的吸附。研究制備了不同胺基含量接枝的MNPs并與商品PSA凈化性能進行比較，優(yōu)化凈化參數(shù)。開發(fā)以胺基功能化MNPs為凈化劑的QuEChERS方法，并與氣相色譜-串聯(lián)質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）結合用于分析果蔬中7 種農(nóng)藥殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)藥標準品猛殺威（99.0%）、二嗪磷（97.5%）、百菌清（99.5%）、甲基溴硫磷（99.5%）、喹硫磷（98.5%）、硫丹（99.7%）、咯菌腈（98.0%） 英國LGC Promochem公司；氯化亞鐵（FeCl2g 4H2O）（分析純） 天津大茂化學試劑廠；氨水（NH3g H2O）（分析純） 北京化工廠；正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilioate，TEOS）（分析純） 天津科密歐化學試劑有限公司；乙腈、正己烷（均為色譜純），無水乙醇、六水合三氯化鐵（III）（FeCl3g 6H2O）、無水硫酸鎂、氯化鈉（NaCl）（均為分析純） 天津凱通化學試劑有限公司；PSA（40 μm） 天津博納艾杰爾科技有限公司；3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷（3-[2-(2-aminoethylamino) ethylamino] propyltrimethoxysilane，AAAPTMS）（純度90%）、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷（N-[3-(trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine，AAPTMS）（純度90%）、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（(3-a m i n o p r o p y l)triethoxysilane，APTES）（純度95%） 上海譜振生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JEM 2010透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子株式會社；Nicolet iN10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀、Escalab 250xi X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；MPMS SQUID VSM磁學測量系統(tǒng) 美國Quantum Design公司；Zetasizer Nano ZS90 Zeta電位分析儀 英國Malvern Panalytical公司；T18 digital Ultra Turrax勻漿器 德國IKA-Werke GmbH & Co.KG公司；TGL-20bR離心機 上海安亭科學儀器廠；QL-861渦旋振蕩器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；KD200氮吹儀 杭州奧盛有限公司；CASCADA IIII-10實驗室凈水系統(tǒng) 頗爾（中國）有限公司；GC-2010 Plu-GCMS-TQ 8030 GC-MS聯(lián)用儀（配備有電子電離源）日本島津株式會社。

1.3 方法

1.3.1 混合標準溶液的配制

稱取一定質量的單個農(nóng)藥標準品溶于甲苯或正己烷中制備100 μg/mL單個標準貯備液。吸取不同體積的單個農(nóng)藥標準貯備溶液于正己烷中稀釋至所需濃度，配制7 種農(nóng)藥的混合標準溶液。

1.3.2 Fe3O4納米粒子的合成

參考Li Yanfei等[5]的方法合成Fe3O4。將FeCl3g 6H2O（5.40 g）置于含100 mL去離子水的500 mL三頸圓底燒瓶中攪拌溶解，迅速將FeCl2g 4H2O（2.00 g）轉移到上述三頸圓底燒瓶中，在氮氣保護下攪拌，并逐滴加入110 mL氨水，滴定速度保持恒定，在30 min內滴定結束；隨后在70 ℃的油浴中快速攪拌3 h，待反應結束后將產(chǎn)物分別用去離子水和無水乙醇各洗滌3 次，置于60 ℃真空干燥箱中干燥24 h。

1.3.3 二氧化硅包覆Fe3O4納米粒子（Fe3O4@SiO2）的合成

參考Lu Yu等[21]的方法合成Fe3O4@SiO2納米粒子，并作適當修改。將0.20 g Fe3O4加入到內有200 mL異丙醇和40 mL去離子水的500 mL三頸圓底燒瓶中。在連續(xù)攪拌下，向混合物中加入1 mL氨水溶液和130 μL TEOS，繼續(xù)攪拌反應3 h；待反應結束后，通過磁鐵收集Fe3O4@SiO2，然后分別用去離子水和無水乙醇各洗滌3 次，最后在真空干燥箱中60 ℃干燥24 h。

1.3.4 胺基功能化Fe3O4@SiO2納米粒子的合成

參考Liu Yue等[22]的方法合成胺基功能化Fe3O4@SiO2納米粒子，并作適當修改。將0.50 g Fe3O4@SiO2超聲分散于50 mL去離子水和50 mL無水乙醇混合溶液中，邊攪拌邊將2 mL硅烷偶聯(lián)劑（APTES、AAPTMS或AAAPTMS）逐滴加入到混合物中。在連續(xù)攪拌下，70 ℃反應24 h；反應結束后自然冷卻至室溫，通過磁鐵收集不同胺基功能化的Fe3O4@SiO2，將產(chǎn)物用去離子水和無水乙醇各洗滌3 次，最后置于真空干燥箱中60 ℃干燥24 h。上述3 種硅烷偶聯(lián)劑接枝的磁性材料分別表示為Fe3O4@SiO2-NH2、Fe3O4@SiO2-PSA和Fe3O4@SiO2-PAAA（圖1）。

圖1 Fe3O4@SiO2-PAAA的合成示意圖Fig.1 Schematic illustration of the synthesis process of Fe3O4@SiO2-PAAA

1.3.5 樣品的制備

稱取10.00 g均質的樣品（番茄、黃瓜或蘋果）于50 mL離心管中，向離心管中加入10 mL體積分數(shù)為1%的乙酸-乙腈溶液，然后用均質器均質30 s，再向離心管中依次加入1.0 g氯化鈉和4.0 g無水硫酸鎂，并立即渦旋混合1 min，然后5 000 r/min離心5 min；將1 mL上層溶液轉移到另一個2 mL裝有一定質量的凈化材料和100 mg無水硫酸鎂的微量離心管中；渦旋一定時間后，通過磁鐵將凈化材料與提取液分離。吸取上清液過0.22 μm微孔濾膜，于GC-MS/MS進樣分析。樣品的制備過程如圖2所示。

圖2 樣品制備過程示意圖Fig.2 Schematic illustration of sample preparation process

1.3.6 GC條件

H P-5 M S 石英毛細管柱（3 0 m h 0.2 5 0 m m，0.25 μm）；進樣口溫度290 ℃；升溫程序：柱溫75 ℃保持3 min，然后以30 ℃/min速率升溫至230 ℃，以6 ℃/min速率升溫至280 ℃并保持3 min。氦氣流速1.2 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣。

1.3.7 MS條件

電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；GC-MS/MS接口溫度280 ℃；監(jiān)控模式多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）。目標物的化學結構、分類、保留時間及質譜參數(shù)見表1。

表1 7 種農(nóng)藥的化學結構、分類、保留時間及質譜參數(shù)Table 1 Chemical structures, assignment, retention times and MS parameters of 7 pesticides

2 結果與分析

2.1 MNPs的表征

2.1.1 形貌分析

圖3 Fe3O4（a）和Fe3O4@SiO2-PAAA（b）的TEM圖Fig.3 TEM images of Fe3O4 (a) and Fe3O4@SiO2-PAAA (b)

由圖3a可以看出，球形Fe3O4的平均直徑約為10 nm左右。圖3b顯示，功能基團包覆在Fe3O4表面并呈現(xiàn)核殼結構。

2.1.2 磁化分析

圖4 Fe3O4和Fe3O4@SiO2-PAAA的磁滯回線Fig.4 Hysteresis loops of Fe3O4 and Fe3O4@SiO2-PAAA

采用振動樣品磁強計測定MNPs的磁化強度，見圖4。Fe3O4和Fe3O4@SiO2-PAAA的飽和磁化強度分別為67.59 emu/g和60.07 emu/g，表明包覆的功能基團對Fe3O4的磁性影響較小。2 個材料均可被磁鐵快速吸附。

2.1.3 FT-IR和XPS分析

圖5 MNPs的FT-IR分析圖譜Fig.5 FT-IR spectra of MNPs

圖6 Fe3O4@SiO2-PAAA的XPS全譜分析Fig.6 XPS survey spectrum of Fe3O4@SiO2-PAAA

通過FT-IR和XPS可驗證MNPs表面接枝的官能團。從圖5可以觀察到，胺基功能化MNPs在1 062 cm-1和794 cm-1處有吸收峰，表明存在Siü Oü Si（不對稱）和Siü O伸縮振動[23]，由此可確定SiO2成功包覆到Fe3O4表面。在1 636 cm-1處的吸收峰為Nü H的彎曲振動，2 922 cm-1的吸收峰代表Cü H的伸縮振動以及在3 422 cm-1處檢測到Nü H的伸縮振動[24]，表明胺基已經(jīng)接枝到MNPs表面。在對Fe3O4@SiO2-PAAA進行的XPS全譜分析中，O1s、C1s和N1s均有吸收峰（圖6），進一步證實了功能基團已接枝到Fe3O4MNPs上。

2.1.4 Zeta電位分析

圖7 MNPs的Zeta電位值Fig.7 Zeta potential of MNPs

膠體粒子的Zeta電位與其表面電荷有關。Zeta電位與胺基表面密度的對數(shù)之間具有良好的相關性。該關系由Zeta電位=38.7+21.6lgσ表示，其中σ定義為每1 nm2的ü NH2基團數(shù)[25]。實驗中測量分散在含1 mmol/L NaNO3的0.1 mol/L HCl中功能化MNPs的Zeta電位值。圖7顯示未改性的Fe3O4@SiO2具有負的Zeta電位，而氨基功能化MNPs Zeta電位為正值。Fe3O4@SiO2-NH2、Fe3O4@SiO2-PSA和Fe3O4@SiO2-PAAA的Zeta電位值分別為26.27、30.04 mV和47.65 mV。因此，計算得到不同氨基功能化MNPs的表面氨基基團數(shù)分別為0.27、0.40 個/nm2和2.60 個/nm2。表明在Fe3O4@SiO2-PAAA表面的氨基含量明顯高于其他2 種胺基接枝的MNPs。

2.2 提取溶劑及鹽的選擇

在果蔬基質的多種農(nóng)藥殘留分析中，應用較多的提取試劑有乙腈、丙酮和乙酸乙酯。對于混合果蔬基質，乙腈與丙酮和乙酸乙酯比較，在GC-MS（全掃描模式）監(jiān)測時，干擾物質最少[3]。因此，本研究選擇的提取試劑為乙腈。目標物百菌清和硫丹是不穩(wěn)定農(nóng)藥，在酸性乙腈中比乙腈中穩(wěn)定性好。方法選擇提取劑為含有體積分數(shù)為1%乙酸的乙腈溶液[26]。

在分配過程中加入NaCl、MgSO4等鹽的目的是增加極性農(nóng)藥在有機相中的分配，從而提高這些農(nóng)藥的回收率。MgSO4比NaCl的吸水性好，但是在吸收水分過程中易形成團塊，并且硫酸鎂吸水是個放熱過程，加入太多不但使后面渦旋操作更困難，同時可能影響熱敏感目標物的穩(wěn)定性。水相中鹽的濃度不僅影響農(nóng)藥在有機相中分配，同時也影響基質中極性組分在有機相中的含量。Anastassiades等[3]發(fā)現(xiàn)在加入一定量的NaCl進行分配平衡時，可以減少有機相中極性組分（糖）的含量。因此本研究選擇MgSO4和NaCl的組合方式吸收分配過程中的水分，在減少有機相中極性干擾物的同時提高目標物的回收率。實驗基于Li Yanfei等[5]的研究，選擇MgSO4和NaCl的添加量為每10 g樣品分別添加4.0 g和1.0 g。

2.3 不同胺基功能化MNPs凈化效果比較

圖8 不同凈化材料處理番茄空白基質的總離子流圖Fig.8 TIC chromatograms of tomato blank matrix by purification with different sorbents

為了評估功能化MNPs的凈化能力，研究以不同氨基功能化MNPs及PSA為凈化劑，對番茄空白樣品進行前處理實驗。從圖8可以看出，保留時間在10～12 min的譜圖中存在較多干擾峰；不同的吸附材料對樣品有不同程度的凈化效果，表現(xiàn)在干擾峰信號的強弱不同。經(jīng)過Fe3O4@SiO2-PAAA凈化的樣品干擾峰最弱，這是因為—NH2和PSA是弱離子交換基團，可與化合物中的極性基團通過氫鍵結合，移除基質中的脂肪酸、有機酸、糖和花青素等雜質。與—NH2比較，由于仲胺的存在，PSA可移除更多的基質共萃物[3]，而Fe3O4@SiO2-PAAA比PSA在結構上還要多1 個氨基，因此對共萃物的吸附能力會更強。

圖9 4 種不同吸附劑對加標回收率的影響Fig.9 Effects of four different sorbents on spiked recoveries

在添加水平為0.5 mg/kg的番茄樣品中，以不同材料為吸附劑得到的回收率結果見圖9?？梢钥闯?，以3 種功能化MNPs為凈化劑處理的樣品中7 種農(nóng)藥（其中硫丹有α和β同分異構體）的添加回收率均高于商品PSA。并且，隨著接枝氨基數(shù)量的增加，百菌清回收率也從44.6%提高到90.0%以上。Fe3O4@SiO2-PSA和Fe3O4@SiO2-PAAA處理的樣品中農(nóng)藥的回收率無太大差別，7 種農(nóng)藥添加回收率集中在84.0%～95.5%之間，但后者處理的樣品相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）相對較低。結合考慮總離子流圖中干擾情況，最后確定Fe3O4@SiO2-PAAA為最優(yōu)的凈化材料。在后續(xù)的實驗中，選擇Fe3O4@SiO2-PAAA為凈化吸附劑。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

對于果蔬基質的凈化，GCB和PSA是最優(yōu)的凈化組合。GCB可去除基質中具有平面結構的物質（葉綠素、固醇等），但也會保留平面結構的農(nóng)藥（如百菌清），并且Anastassiades等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)葉綠素在GC-MS上并未顯示出干擾峰。因此，方法中僅選擇Fe3O4@SiO2-PAAA作為凈化劑。

圖10 凈化劑用量（A）和凈化時間（B）對目標農(nóng)藥提取效率的影響Fig.10 Effects of sorbent dosage (A) and clean-up time (B) on the extraction efficiency of the target pesticides

研究比較了Fe3O4@SiO2-PAAA不同用量對目標物添加回收率的影響。番茄樣品中添加0.5 mg/kg農(nóng)藥混合標準溶液，然后按照樣品的制備方法處理樣品，其中凈化劑用量分別為20、30、40、50 mg和60 mg。從圖10A可以看出，50 mg添加量處理的樣品獲得最好的添加回收率，在72.2%～93.0%范圍內。其中溴硫磷、喹硫磷和咯菌腈的回收率隨凈化劑用量的改變，變化較大。因此方法確定凈化劑添加量為50 mg。

在最佳實驗條件下，對凈化時間進行優(yōu)化。凈化時間分別為20、30、40、50、60 s和70 s。從圖10B可以看到，凈化時間在20～70 s內，回收率差別不大。原因可能是在較短的時間內凈化劑對干擾物的吸附就已經(jīng)達到了平衡，從效率及添加回收率考慮，方法的凈化時間確定為20 s。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性方程、檢出限和定量限結果

向空白基質中加入不同濃度的混合標準溶液，繪制標準曲線。分析物的含量最高不超過1 mg/kg。確定最佳的檢測范圍及相關系數(shù)。方法檢出限（limit of detection，LOD）是信噪比（RSN）為3時檢測目標物的含量；定量限（limits of quantitation，LOQ）為RSN為10時檢測目標物的含量。如表2所示，每種目標物均表現(xiàn)出良好的線性，線性范圍在0.007～1.000 mg/kg之間；線性相關系數(shù)（R2）高于0.994；方法LOD范圍在0.002～0.005 mg/kg之間；LOQ在0.007～0.017 mg/kg之間。

表2 7 種農(nóng)藥的校準曲線、回歸數(shù)據(jù)、檢出限和定量限Table 2 Calibration curve equations, LODs, and LOQs of seven pesticides (n= 3)

2.5.2 基質效應

以不分流方式進樣的GC進樣口以及分離柱中存在各種活性位點，這些活性位點不可逆吸附和/或催化（熱）分解一些敏感分析物。除了玻璃內襯表面中可能存在的游離硅烷醇基和金屬之外，其他活性位點也可能來自前部的非揮發(fā)性共萃取物[27]。產(chǎn)生基質誘導色譜增強或抑制作用的化合物通常是熱不穩(wěn)定的或者是極性的、易于發(fā)生氫鍵鍵合的化合物。影響基質增強效應的因素有分析物的化學結構及濃度，通常分析物濃度越低基質增強效應越明顯；另一個重要因素是基質的組成。基質效應用試劑標準和基質標準制作的校準曲線斜率表示[28]。

基質效應值為正數(shù)表明基質對信號有增強作用。相反，為負數(shù)則表明基質對信號有抑制作用。從圖11可以看出，新建方法處理的番茄、蘋果和黃瓜樣品中不同農(nóng)藥的基質效應不同。與黃瓜比較，番茄和蘋果中7 種農(nóng)藥的基質效應較低。參照Zhang Zihao等[6]的分類方法，基質效應絕對值≤20%，基質無影響；20%＜基質效應絕對值≤50%，中等強度基質效應；基質效應絕對值＞50%，強的基質效應。以這個分類標準可以判斷，新建的分析方法中番茄和蘋果無基質效應。黃瓜基質中猛殺威和二嗪磷無基質效應，百菌清表現(xiàn)為強基質抑制效應，其他農(nóng)藥均顯示中等強度基質增強效應。由圖11可以看出，與其他農(nóng)藥比較，百菌清和甲基溴硫磷2 種農(nóng)藥受基質影響較大。

2.5.3 回收率和精密度結果

實驗對番茄、蘋果和黃瓜3 種基質分別進行了LOQ、2 倍LOQ和10 倍LOQ三個水平的添加回收率實驗，每個樣品設置5 個平行，回收率在70%～110%之間，RSD低于20%認為可接受。由表3可知，方法添加回收率在75.2%～105.4%范圍內，RSD在3.7%～15.7%之間。結果表明以Fe3O4@SiO2-PAAA為磁性吸附劑改進的QuEChERS方法，結合GC-MS/MS分析果蔬中7 種農(nóng)藥殘留，檢測方法具有較好的準確度和精密度。

表3 蘋果、番茄和黃瓜中7 種農(nóng)藥的添加回收率及RSDTable 3 Recoveries and RSDs of 7 pesticides in spiked apples,tomatoes and cucumbers (n= 5)

2.6 實際樣品分析

為了明確方法的適用性，分別從超市及農(nóng)貿(mào)市場購買番茄、蘋果和黃瓜各2 組不同品種的樣品，每組5 份共30 份。按照新開發(fā)的方法檢測其中的農(nóng)藥殘留。其中1 組番茄樣品中檢測到了百菌清，含量為0.027 mg/kg?？赡艿脑蚴寝r(nóng)戶在未過農(nóng)藥安全間隔期即進行了采收。

3 結 論

研究制備了具有高磁化強度的Fe3O4@SiO2-PAAA納米粒子。開發(fā)了以Fe3O4@SiO2-PAAA為吸附劑的改進的QuEChERS方法，結合GC-MS/MS可同時測定果蔬中的7 種農(nóng)藥殘留。建立的方法操作簡單、快速；線性范圍寬、檢出限低、準確度高。Fe3O4@SiO2-PAAA可作為替代PSA的凈化劑。本研究對新材料在農(nóng)藥多殘留分析中的應用具有一定的指導意義。